Phosphatase and tensin homolog (PTEN) is a tumour suppressor, which antagonises the PI3K / AKT pathway and thereby regulates cell growth, maturation, proliferation, and cellular survival. PTEN signalling might influence neuronal survival after brain ischemia, but results are controversial and the neuroprotective mechanism is not clear. The recently identified translational variant PTEN-L has not been examined in the context of brain ischemia. PTEN-L is transcribed from an alternative CTG start codon N-terminal and in frame with the PTEN sequence, which results in a longer protein with 173 additional amino acids. In the present study, PTEN-L was identified in murine primary neurons and brain lysates by mass spectrometry. I established an in vitro model using primary neurons derived from conditional PTEN knock-out mice to analyse the effect of PTEN and PTEN-L independently while avoiding overexpression. PTEN-L, unlike PTEN, localised predominantly in the cytosol of neurons and a rapid cellular re-distribution was observed after neurons were exposed to ischemic-like stress. Neurons with genomic ablation of both PTEN variants were compared to neurons expressing PTEN or PTEN-L in terms of neuronal survival after oxygen-glucose deprivation (OGD): PTEN knock-out neurons showed increased cell death and vulnerability to OGD, while replacement with either PTEN-L or PTEN protected neurons against stress. However, neurons expressing PTEN-L fared best and showed significantly less cell death than PTEN transduced neurons. Forced expression of PTEN-L NLS to the nucleus did not rescue neurons against ischemic-like stress. To get an insight into the molecular mechanisms, which could explain the resilience of PTEN-L expressing neurons, protein binding-partners were identified via mass spectrometry, using cellular fractions of nucleus and cytosol. The stress-regulated interactome of PTEN-L and PTEN differed significantly, which speaks for a specific function of the N-terminal unstructured region in regulating neuronal survival via protein-protein interactions. One candidate specifically enriched with PTEN-L in the cytosolic compartment was GRB2-associated-binding protein 2 (Gab2), which is an adaptor protein of tyrosine kinase receptors that influences several downstream pathways including PI3K / AKT signalling. A proximity-ligation assay confirmed that Gab2 was enriched with PTEN-L close to the plasma membrane and the PTEN-L / Gab2 complex was dissolved in response to ischemic-like stress. In summary, the results show that PTEN-L and PTEN have distinct functions in response to cellular stress in neurons. PTEN-L might promote neuronal survival after cerebral ischemia by interacting with proteins via binding sites located in the N-terminal region, such as Gab2.
Phosphatase and tensin homolog (PTEN) ist ein Tumorsuppressor, welcher die PI3K / AKT Signalkaskade antagonisiert und unter anderem Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Zellproliferation und Zellüberleben beeinflusst. Es gibt Hinweise, dass die PTEN Regulation mit neuronalem Überleben nach ischämischem Stress in Verbindung steht, allerdings werden die Ergebnisse kontrovers diskutiert und der neuroprotektive Mechanismus ist bisher unklar. Der Einfluss der kürzlich identifizierten translationalen Variante PTEN-L wurde im Kontext von zerebraler Ischämie noch nicht untersucht. PTEN-L wird von einem alternativen CTG Startkodon translatiert, welches N-terminal und im offenen Leserahmen des PTEN Proteins liegt. Dadurch entsteht ein Protein mit 173 zusätzlichen Aminosäuren am N-terminus. In der vorliegenden Studie wurde PTEN-L in primären Neuronen und im Gehirn von Mäusen durch Massenspektrometrie nachgewiesen. Ein in vitro Model mit primären Neuronen von konditionalen PTEN knock-out Mäusen wurde etabliert, welches einen direkten Vergleich von PTEN-L oder PTEN exprimierenden Zellen ermöglicht und Überexpression vermeidet. Im Gegensatz zu PTEN lokalisierte PTEN-L größtenteils im Zytosol von Neuronen und reagierte auf ischämie-ähnlichen Stress mit einer schnellen subzellulären Umverteilung auf Nukleus und Zytosol. PTEN knock-out Neurone wurden mit PTEN-L oder PTEN exprimierenden Neuronen in Bezug auf ihr zelluläres Überleben nach experimentellem Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD) verglichen. PTEN knock-out Neurone waren vulnerabler und zeigten vermehrten Zelltod nach OGD, während die Expression von entweder PTEN-L oder PTEN das Zellüberleben verbesserte. Im direkten Vergleich schnitten PTEN-L exprimierende Neurone besser ab und zeigten signifikant weniger Zelltod als PTEN exprimierende Neurone. Kein gesteigertes Zellüberleben wurde beobachtet, wenn Neurone ausschließlich PTEN-L NLS im Nukleus exprimierten. Um einen Einblick in die molekularen Mechanismen zu bekommen, welche die Resilienz der PTEN-L exprimierenden Neurone erklären könnten, wurden via Zellfraktionierung in nukleäre und zytosolische Kompartimente und Massenspektrometrie Proteinbindungspartner identifiziert. PTEN-L und PTEN zeigten ein unterschiedliches stressreguliertes Interaktom was darauf hinweist, dass die N-terminale unstrukturierte Region durch Protein-Protein Interaktionen neuronales Überleben regulieren könnte. Eines der interagierenden Proteine, welches sich ausschließlich mit PTEN-L im zytosolischen Kompartment anreicherte, war GRB2-associated-binding protein 2 (Gab2). Gab2 ist ein Adaptorprotein der Tyrosinkinase Rezeptoren, welches unter anderem den PI3K / AKT Signalweg beeinflusst. Ein Proximity-Ligation Assay bestätigte, dass Gab2 mit PTEN-L in der Nähe der Plasmamembran einen Komplex bildet, welcher sich nach ischämie-ähnlichem Stress auflöst. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass PTEN-L und PTEN nach ischämie-ähnlichem Stress unterschiedlich reguliert werden und wahrscheinlich unabhängig zu der Stressantwort von Neuronen beitragen. PTEN-L könnte zelluläres Überleben nach zerebraler Ischämie fördern, indem es mit Proteinen wie zum Beispiel Gab2 über Proteinbindungsstellen in seiner N-terminalen Sequenz interagiert.
