dc.contributor.author
Jörs, Simone
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:29:18Z
dc.date.available
2011-12-13T14:23:36.968Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2610
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6811
dc.description.abstract
TRPML3 belongs to the mucolipin subfamily of the transient receptor potential
(TRP) channels. The mouse Trpml3 gene was identified in a positional cloning
project to identify the gene responsible for the varitint-waddler (Va) mouse
phenotype, which displays severe auditory, vestibular and pigmentation
defects. A single A419P amino acid substitution within the predicted 5th
transmembrane domain of TRPML3 was identified to cause this Va phenotype. The
A419P mutation renders TRPML3 constitutively active, resulting in highly
elevated [Ca2+]i and apoptotic cell death in cells that natively express
TRPML3, such as melanocytes and sensory hair cells. However, it is remarkable
that sensory hair cells of Va mice survive for several postnatal weeks.
Presented here are in vitro and in vivo data supporting the hypothesis that
the survival of Va hair cells is linked to their ability to deal with Ca2+
loads due to the abundance of plasma membrane calcium ATPases (PMCAs). The
rescue effect of PMCA2 is due to the decrease in [Ca2+]i. Ca2+-buffering and
Ca2+ extrusion abilities of hair cells are powerful enough to prevent cell
death for weeks, even in the presence of constitutively active TRPML3(A419P),
which is able to induce rapid apoptosis in other cells. To gain more insight
into the function of the wild-type TRPML3 channel, a high-throughput small
molecule activator screen was conducted. In this screen 53 compounds were
identified that selectively activate TRPML3. Cheminformatics analyses of
compounds revealed 9 different chemical scaffolds and 20 singletons. However,
testing compounds on sensory hair cells revealed the absence of activator-
responsive channels. Melanocytes showed weak or no responses to the compounds,
except for SN-2, which when used at a relatively high concentration was able
to elicit a significant increase of the intracellular Ca2+ concentration. The
lack of substantial responses to identified activators suggested that TRPML3
in native cells is either present only in limited numbers in the plasma
membrane or that the protein heteromerizes with other proteins, leading to
channels that are not or only weakly responsive to the compounds. To elucidate
the physiological role of murine TRPML3, a conditional knockout of Trpml3 was
generated. Despite the strong Va phenotype, no overt inner ear phenotype was
detectable in mice with ubiquitous Trpml3 inactivation or when the gene was
inactivated from P0-P3 onwards. Both mouse models revealed that TRPML3 as a
homomer is not essential for detectable inner ear function and developmet in
vivo. Although these results do not necessarily exclude TRPML3 from playing a
role in mechanotransduction, they do reveal that if the transduction channel
complex utilizes TRPML3, TRPML3 may function as a dispensable subunit.
de
dc.description.abstract
TRPML3 gehört zu der Mukolipin Subfamilie der TRP (transient receptor
potential) Kanäle. Das Trpml3 Gen wurde in einem positionalen
Klonierungsprojekt identifiziert, um das verantwortliche Gen für den varitint-
waddler (Va) Phänotyp mit schwerwiegenden auditorischen, vestibulären und
Pigmentierungsdefekten zu bestimmen. Ein Aminosäureaustausch (A419P) innerhalb
des 5. Transmembransegments von TRPML3 ist verantwortlich für den Va Phänotyp.
Der A419P Austausch macht TRPML3 konstitutiv aktiv, was zu erhöhtem [Ca2+]i
und zu programmierten Zelltod in Zellen mit nativem TRPML3, wie z.B.
Melanozyten und sensorische Haarzellen, führt. Bemerkenswert ist, dass
sensorische Haarzellen von Va Mäusen für mehrere postnatale Wochen überleben.
In der vorliegenden Arbeit wurde in vivo und in vitro untersucht, inwiefern
das Überleben der Va-Haarzellen und deren Fähigkeit mit der Ca2+-Belastung
umzugehen, gekoppelt ist an die gleichzeitige Präsenz von
Plasmamembranständigen Ca2+-ATPasen (PMCAs). Es wurde gezeigt, dass die
Fähigkeit der sensorischen Haarzellen Ca2+ zu puffern und zu extrudieren ist
ausreichend, um den Zelltod für mehrere Wochen hinauszuzögern, auch in
Anwesenheit der konstitutiv aktiven TRPML3(A419P)-Variante, welche in anderen
Zelltypen fähig ist einen schnellen Zelltod zu induzieren. Der Rettungeffekt
ist die Folge der Reduzierung des [Ca2+]i. Um einen Einblick in die Funktion
von Wildtyp-TRPML3 zu erlangen, wurde in einem Hochdurchsatzverfahren nach
chemischen Aktivatoren gesucht. Es wurden 53 Verbindungen identifiziert, die
TRPML3 selektiv aktivieren. Ein Test dieser Verbindungen auf TRPML3
exprimierende Kochleapräparate zeigte jedoch, dass auditorische Haarzellen
nicht auf diese Aktivatoren reagieren. Hautmelanozyten zeigten nur schwache
oder ebenfalls keine Antworten auf die Aktivatoren, mit Ausnahme der Substanz
SN-2, welche einen signifikanten Anstieg der intrazellulären
Ca2+-Konzentration hervorrief. Das Fehlen einer verbesserten Antwort auf die
TRPML3 Aktivatoren kann dadurch erklärt werden, dass TRPML3 in nativen Zellen
in der Plasmamembran nur in limitierender Menge vorkommt oder dass TRPML3 mit
anderen Proteinen heteromerisiert, was zu multimeren Kanalkomplexen führt, die
nicht oder nur schwach auf die Verbindungen reagieren. Um die physiologische
Rolle des TRPML3’s im inneren Ohr aufzuklären, wurde eine konditionaler Trpml3
Inaktivierung generiert. Trotz des schwerwiegenden Va Phänotyps konnte kein
Innenohrphänotyp in Mäusen mit ubiquitärer Trpml3 Inaktivierung oder wenn das
Gen ab P0-P3 inaktiviert wurde, gezeigt werden. Beide Mausmodelle zeigten,
dass TRPML3 als Homomer nicht essenziell für den Hörprozess ist. Die
Ergebnisse schliessen TRPML3 nicht unbedingt von einer Rolle im Prozess der
auditorischen Mechanotransduktion aus. Sie verraten jedoch, falls TRPML3 zum
Mechanotransduktionskomplex gehört, dass das TRPML3-Protein als eine
ersetzbare Untereinheit fungieren könnte.
de
dc.format.extent
XIII, 136 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Transient receptor potentialcal
dc.subject
varitint-waddler
dc.subject
knockout, highthroughput activator screen, hearing
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Insights into the function and pharmacology of the TRPML3 cation channel
dc.contributor.contact
simone_joers@yahoo.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Constance Scharff
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Stefan Heller
dc.date.accepted
2011-07-06
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000034777-9
dc.title.translated
Funktionelle und pharmakologische Charakterisierung des TRP-Kationenkanals
TRPML3
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000034777
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000010368
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access