TRPML3 belongs to the mucolipin subfamily of the transient receptor potential (TRP) channels. The mouse Trpml3 gene was identified in a positional cloning project to identify the gene responsible for the varitint-waddler (Va) mouse phenotype, which displays severe auditory, vestibular and pigmentation defects. A single A419P amino acid substitution within the predicted 5th transmembrane domain of TRPML3 was identified to cause this Va phenotype. The A419P mutation renders TRPML3 constitutively active, resulting in highly elevated [Ca2+]i and apoptotic cell death in cells that natively express TRPML3, such as melanocytes and sensory hair cells. However, it is remarkable that sensory hair cells of Va mice survive for several postnatal weeks. Presented here are in vitro and in vivo data supporting the hypothesis that the survival of Va hair cells is linked to their ability to deal with Ca2+ loads due to the abundance of plasma membrane calcium ATPases (PMCAs). The rescue effect of PMCA2 is due to the decrease in [Ca2+]i. Ca2+-buffering and Ca2+ extrusion abilities of hair cells are powerful enough to prevent cell death for weeks, even in the presence of constitutively active TRPML3(A419P), which is able to induce rapid apoptosis in other cells. To gain more insight into the function of the wild-type TRPML3 channel, a high-throughput small molecule activator screen was conducted. In this screen 53 compounds were identified that selectively activate TRPML3. Cheminformatics analyses of compounds revealed 9 different chemical scaffolds and 20 singletons. However, testing compounds on sensory hair cells revealed the absence of activator- responsive channels. Melanocytes showed weak or no responses to the compounds, except for SN-2, which when used at a relatively high concentration was able to elicit a significant increase of the intracellular Ca2+ concentration. The lack of substantial responses to identified activators suggested that TRPML3 in native cells is either present only in limited numbers in the plasma membrane or that the protein heteromerizes with other proteins, leading to channels that are not or only weakly responsive to the compounds. To elucidate the physiological role of murine TRPML3, a conditional knockout of Trpml3 was generated. Despite the strong Va phenotype, no overt inner ear phenotype was detectable in mice with ubiquitous Trpml3 inactivation or when the gene was inactivated from P0-P3 onwards. Both mouse models revealed that TRPML3 as a homomer is not essential for detectable inner ear function and developmet in vivo. Although these results do not necessarily exclude TRPML3 from playing a role in mechanotransduction, they do reveal that if the transduction channel complex utilizes TRPML3, TRPML3 may function as a dispensable subunit.
TRPML3 gehört zu der Mukolipin Subfamilie der TRP (transient receptor potential) Kanäle. Das Trpml3 Gen wurde in einem positionalen Klonierungsprojekt identifiziert, um das verantwortliche Gen für den varitint- waddler (Va) Phänotyp mit schwerwiegenden auditorischen, vestibulären und Pigmentierungsdefekten zu bestimmen. Ein Aminosäureaustausch (A419P) innerhalb des 5. Transmembransegments von TRPML3 ist verantwortlich für den Va Phänotyp. Der A419P Austausch macht TRPML3 konstitutiv aktiv, was zu erhöhtem [Ca2+]i und zu programmierten Zelltod in Zellen mit nativem TRPML3, wie z.B. Melanozyten und sensorische Haarzellen, führt. Bemerkenswert ist, dass sensorische Haarzellen von Va Mäusen für mehrere postnatale Wochen überleben. In der vorliegenden Arbeit wurde in vivo und in vitro untersucht, inwiefern das Überleben der Va-Haarzellen und deren Fähigkeit mit der Ca2+-Belastung umzugehen, gekoppelt ist an die gleichzeitige Präsenz von Plasmamembranständigen Ca2+-ATPasen (PMCAs). Es wurde gezeigt, dass die Fähigkeit der sensorischen Haarzellen Ca2+ zu puffern und zu extrudieren ist ausreichend, um den Zelltod für mehrere Wochen hinauszuzögern, auch in Anwesenheit der konstitutiv aktiven TRPML3(A419P)-Variante, welche in anderen Zelltypen fähig ist einen schnellen Zelltod zu induzieren. Der Rettungeffekt ist die Folge der Reduzierung des [Ca2+]i. Um einen Einblick in die Funktion von Wildtyp-TRPML3 zu erlangen, wurde in einem Hochdurchsatzverfahren nach chemischen Aktivatoren gesucht. Es wurden 53 Verbindungen identifiziert, die TRPML3 selektiv aktivieren. Ein Test dieser Verbindungen auf TRPML3 exprimierende Kochleapräparate zeigte jedoch, dass auditorische Haarzellen nicht auf diese Aktivatoren reagieren. Hautmelanozyten zeigten nur schwache oder ebenfalls keine Antworten auf die Aktivatoren, mit Ausnahme der Substanz SN-2, welche einen signifikanten Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration hervorrief. Das Fehlen einer verbesserten Antwort auf die TRPML3 Aktivatoren kann dadurch erklärt werden, dass TRPML3 in nativen Zellen in der Plasmamembran nur in limitierender Menge vorkommt oder dass TRPML3 mit anderen Proteinen heteromerisiert, was zu multimeren Kanalkomplexen führt, die nicht oder nur schwach auf die Verbindungen reagieren. Um die physiologische Rolle des TRPML3’s im inneren Ohr aufzuklären, wurde eine konditionaler Trpml3 Inaktivierung generiert. Trotz des schwerwiegenden Va Phänotyps konnte kein Innenohrphänotyp in Mäusen mit ubiquitärer Trpml3 Inaktivierung oder wenn das Gen ab P0-P3 inaktiviert wurde, gezeigt werden. Beide Mausmodelle zeigten, dass TRPML3 als Homomer nicht essenziell für den Hörprozess ist. Die Ergebnisse schliessen TRPML3 nicht unbedingt von einer Rolle im Prozess der auditorischen Mechanotransduktion aus. Sie verraten jedoch, falls TRPML3 zum Mechanotransduktionskomplex gehört, dass das TRPML3-Protein als eine ersetzbare Untereinheit fungieren könnte.
