Introduction Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies worldwide. The role of the Hedgehog (Hh) signaling pathway in CRC is controversial. Based on previous data suggesting either a paracrine or autocrine tumor-supportive role for Hh, a clinical trial with a specific Hh inhibitor was conducted, but yielded a negative result. The aim of this study was to elucidate the role of Hh signaling in the development and progression of CRC based on CRC mouse models. Methods The role of Hh signaling in tumor-stroma crosstalk was analyzed based on chemically induced inflammation-driven and sporadic tumor models that were combined with different genetically modified mouse strains. By applying immunohistochemistry (IHC) and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in combination with Hh reporter mice, we investigated the activation of the Hh pathway in murine colonic tumors. Furthermore, we used microarray technology for gene expression analysis in mice with genetic activation of the Hh pathway. Additionally, we analyzed gene expression data sets of murine or human stromal cells treated with Hh ligands in vitro. Results Hh reporter mice revealed that downstream Hh signaling remains stromal in murine colonic tumors and that the canonical Hh pathway is down-regulated during tumorigenesis. Transgenic mice with activated Hh signaling in stromal cells showed reduced tumor burden in both tumor models. In further support of a protective effect of the Hh pathway in CRC, we found down-regulation of the tumor-promoting epithelial transcription factor PROX1 upon genetic Hh activation in the stroma. Bone morphogenetic protein (BMP) signaling acts as a differentiation factor in the intestinal epithelium and is regulated by Hh signaling. Analysis of epithelial p-SMAD1/5 expression, a readout of active BMP signaling, revealed an association of Hh activity in the stroma with increased BMP pathway activity in the adjacent epithelial compartment. Gene expression data suggested that stromal Hh activation diminishes BMP inhibitor expression. Finally, analysis of gene expression in fibroblasts treated with Hh ligand in vitro confirmed down-regulation of BMP inhibitor expression upon activation of Hh signaling in intestinal stromal cells. Conclusion Together, the results suggest a tumor-protective role of stromal Hh activation on CRC formation in mice, which may partly be achieved through alterations in the Hh-BMP axis.
Einleitung Das kolorektale Karzinom (CRC) ist einer der häufigsten Tumore weltweit. Die Rolle des Hedgehog (Hh) Signalweges für die Pathogenese des CRC ist umstritten. Basierend auf früheren Daten, welche eine parakrine oder autokrine protumorigene Rolle des Hh Signalweges nahelegten, ist eine klinische Studie mit einem spezifischen Hh Inhibitor durchgeführt worden, die jedoch keinen positiven Effekt der Hh Inhibition nachweisen konnte. Das Ziel dieser Studie war es daher, die Rolle des Hh Signalweges in der Entstehung und Entwicklung vom CRC in Mausmodellen zu untersuchen. Methodik Ein durch die Applikation von chemischen Karzinogenen hervorgerufenes Entzündungs-abhängiges sowie ein sporadisches CRC Tumormodell wurden in Kombination mit verschiedenen transgen veränderten Mausstämmen genutzt, um die Rolle des Hh Signalweges in Wechselspiel zwischen Tumor und Stroma zu analysieren. Mit Hilfe von Immunhistochemie (IHC) und quantitativer Echtzeit-PCR (RT-qPCR) in Kombination mit Hh Reportermäusen wurde die Expression des Hh Signalweges in murinen Kolontumoren untersucht. Für Genexpressionsanalysen wurde die Microarray Technologie an Mäusen mit genetisch induzierter Hh-Aktivierung angewandt. Zusätzlich wurden Genexpressionsdatensätze, in denen murine und humane stromale Zellen in vitro mit Hh Liganden behandelt wurden, hinsichtlich der Expression von Hh-regulierten Genen untersucht. Ergebnisse Wir konnten zeigen, dass die Aktivierung des „kanonischen“ Hh Signalweges in murinen Kolontumoren auf das Stroma beschränkt ist und dass Hh Zielgene herunterreguliert sind. Mäuse mit Aktivierung von Hh in stromalen Zellen zeigten eine verminderte Tumorlast. Weiterhin konnten wir zeigen, dass es nach Aktivierung von Hh zu einer Runterregulierung des protumorigenen Transkriptionsfaktors PROX1 kommt. Der „bone morphogenetic protein“ (BMP) Signalweg hatte eine pro-differenzierende Rolle im Epithel und wurde durch Hh Signale gesteuert. IHC für p-SMAD1/5, welche die Aktivierung des BMP Signalweges signalisieren, zeigte, dass die Aktivität von Hh im Stroma mit erhöhten BMP Signalen im Epithelium einhergeht. In der Genexpressionsanalyse zeigte sich, dass stromale Hh Aktivierung die Expression von BMP Inhibitoren vermindert, welches sich in der Analyse von Genexpressionsmuster in intestinalen Fibroblasten in vitro bestätigte. Schlussfolgerung Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass stromale Hh Aktivierung eine protektive Rolle auf die Entstehung von CRC in Mausmodellen ausübt, die zumindest in Teilen durch die Hh-BMP Achse vermittelt wird.
