Pluripotent stem cells have an enormous potential to self-renew indefinitely and differentiate into ectoderm, mesoderm and endoderm, the three germ layers of the body. This striking ability has turned PSCs throughout the years to be a major driver of regenerative medicine research and applications that utilize such cells for generation of cell types of interest thereby including disease modeling, drug screening and cell replacement-based therapies. However, creating PSC-based differentiation platforms that ensure derivation of homogenous cultures for desired clinically relevant cell types is critical for meaningful understanding and usage of such cells for therapy. Currently, cell heterogeneity is still one of the major hurdles for cell replacement-based therapy even following decades of stem cell research. Therefore one of the major goals of the field is to develop strategies for generating homogenous cell types from PSCs.
Our lab is mainly interested in studying PSC-based central nervous system (CNS) development, with particular focus on the development of the cerebral cortex. The cerebral cortex (or neocortex) is the newly evolved and most complex structure of human brain, which is the site for higher order functions such as sensory perception, cognition and emotions. Methods for deriving cortical progenitors from PSCs are highly diverse and largely lack robust readouts, and hence are prone to yield heterogeneous populations that contain both cortical and non-cortical CNS cell types among other non-neural cell types. Combining knowledge from in vivo cortical developmental studies and previous findings from our lab on in vitro studies of neural differentiation from PSCs, in this study we show a streamlined strategy to generate homogenous cortical progenitors from PSCs by inhibiting WNT pathway on top of routinely used dual SMAD inhibition. We perform a systematic comprehensive comparison, at both molecular and cellular levels, of previously the major known cortical differentiation paradigms side by side with our combined WNT and dual SMAD inhibition (Triple-i) paradigm in both 2D monolayer and 3D organoid culture platforms.
We employ bulk RNA-Sequencing and analysis of 10,000 differentially expressed genes among single organoids and human brain samples to reveal that combined WNT and dual SMAD inhibition exclusively reproduces neocortical fates, dual SMAD inhibition induces diencephalic-mid-hindbrain fates, and inhibition-free conditions promote mixed fates. Further employing Single cell RNA-Sequencing we confirm the brain regional heterogeneity observed in bulk RNA-Seq, highlighting enriched cortical stem cell population in organoids derived under combined WNT and dual SMAD inhibition. On the other hand, we find that dual SMAD-i and inhibitor-free organoids are heterogeneous consisting of both cortical and non-cortical populations. Single cell RNA-Sequencing also confirm the presence of the major cortical cell types including neural stem cells, intermediate progenitors and neurons in organoids derived by both dual SMAD-i and Triple-i.
In this study we also revisit the role of radial organization (rosette formation) – conventionally known to mark general neural fate conversion - and assign it as unique feature of cortical NSCs. We particularly show that enhanced Notch activation (stemness) and efficient radial organization are integral and overlapping hallmarks of homogeneous neocortical specification. We also show that this feature is dramatically streamlined under Triple-i in both 2D (rosettes) and 3D (organoids) systems, thus functionally linking stemness, cell polarity and the robust acquisition of cortical fates under combined inhibition. In support to this finding, inhibitor-free cultures exhibit weak Notch activation not necessarily overlapping radial organization, while SMAD cultures show Notch activation in non-radially organized regions enriched for non-cortical fates. We therefore propose these features – when overlapping – could be used as reliable readouts for efficient cortical differentiation.
As a proof of concept for the utility of our findings for regenerative medical research and applications, we use brain organoid technology as platform to model neurodevelopmental disorders such as microcephaly. Microcephaly is a genetically heterogeneous cortical developmental disorder characterized by abnormalities in the development of the cortex resulting in smaller brain size. We derive microcephaly organoids by generating hESCs harboring defects in the centrosomal protein STIL, and show that such organoids display apoptosis within Notch active and radially organized vesicles, arrest in cell cycle, premature differentiation and loss of cortex specific marker expression only when derived by combined WNT and dual SMAD inhibition, demonstrating cortex-specific etiology. Thus, combined WNT and dual SMAD inhibition is indispensable for standardized modeling of corticogenesis in health and disease.
Pluripotente Stammzellen (PSCs) haben ein enormes Potential zur unbegrentzen Selbsterneuerung und Differenzierung zu den drei Keimschichten des Körpers: ektoderm, mesoderm und endoderm. Diese auffällige Kapazität hat dazu geführt, dass PSCs eine wichtige Rolle in der regenerativen Medizinforschung spielen. Ihr Potential, verschiedene Zellenarten zu generieren, ermöglicht ihre Verwendung in vielen Bereichen, zum Beispiel Krankheitsmodellierung, Drogenscreening und Zellensubstitutionstherapien. Um die PSCs erfolgreich für diese Therapien anzuwenden, braucht man Differenzierungsplatformen, die Herleitung homogener Zellkulturen für klinisch relevante Zellenarten sicherstellen. Auch nach Jahrzehnten der Stammzellforschung ist die Zellenheterogenität derzeit eine der größten Hürden für Zellensubstitutionstherapien. Deshalb ist eins der größten Ziele dieses Forschungbereichs Strategien für die Generierung homogener Zellenarten aus PSCs zu entwickeln.
Unser Labor interessiert sich hauptsächlich dafür, die Herstellung vom Zentralnervensystem (ZNS), besonders von der Großhirnrinde, von pluripotenten Stammzellen zu studieren. Die Großhirnrinde (der Neocortex) ist die neuentwickelte und komplizierteste Struktur des Menschengehirns, das für Funktionen höherer Schichten, z.B. die Sinneswahrnehmung, Kognition, und Emotion, verantwortlich ist. Die Methoden, die zurzeit für die Herstellung von Kortikalprogenitorzellen angewendet werden, sind sehr vielfältig und haben einen Mangel an robusten Auslesungen. Deswegen haben diese Methoden das Problem, dass sie heterogene Populationen von kortischen und nicht kortischen Zellenarten des ZNS und dazu nicht neurale Zellenarten herstellen. Durch die Kombination des Wissens von in vivo Studien über die kortische Entwicklung und vorherigen in vitro Ergebnissen unseres Labors über Neuraldifferenzierung von PSCs, zeigen wir in dieser Studie eine stromlinienförmige Strategie. Diese Strategie erschafft homogene Kortikalprogenitorzellen von PSCs durch die Inhibition von dem WNT Signalweg und die routinemäßig benutzten dual SMAD Inhibition (Triple-i). Wir führen einen systematisch umfassenden Vergleich in molekularen und zellularen Ebenen durch. Wir vergleichen die bisherigen Methoden, die für den kortischen Differenzierungsprozess angewendet sind, mit unserer Triple-i Methode in 2D Monoschichten und 3D organoidzüchtungplatformen.
Wir benutzen bulk RNA Sequenzieren und die Analyse von 10.000 differentiell exprimierten Genen zwischen organoids und Proben von Menschengehirnen. Wir stellen fest, dass die Kombination der Inhibition von dem WNT Signalweg und dual SMAD Inhibition das neokortische Zellschicksal ausschließlich erschafft. Wir zeigen auch, dass die dual SMAD Inhibition diencephalic-mid-hindbrain Zellschicksalen ermöglicht und dass keine Inhibition gemischte Zellschicksale fördert. *Weiterhin bestätigen wir mit der Einstellung Einzel-Zell RNA Sequenzieren (single cell RNA-Sequencing) die regionale Heterogenität zwischen organoid Entwicklungsmethoden, die wir in bulk RNA-Seq gesehen haben. Durch die Analyse von scRNA-Seq Daten von Gehirnorganoids finden wir dazu eine hochangereichte kortische Stammzellpopulation in Triple-i organoids. Wir finden aber auch, dass dual SMAD-i organoids und organoids unter keiner Inhibition mehr heterogen sind. Diese organoids enthalten kortische und nicht kortische Zellpopulationen. Single cell RNA-Sequencing bestätigt die Anwesenheit wichtiger kortischer Zellenarten inklusive Nervenstammzellen, Kortikalprogenitorzellen und Nervenzellen in dual SMAD-i und Triple-i organoids.
In dieser Studie untersuchen wir u.a. die Rolle von der radialen Organisation (Rosettebildung), die eine wichtige Rolle in dem Nervenzellschicksal spielt. Diese Organisation wird dann als einzigartige Eigenschaft den kortischen Nervenstammzellen zugewiesen. Insbesondere zeigen wir die integrale Rolle von vergrößerter Notch Aktivierung für effiziente radiale Organisation. Diese beiden Charakterisierungen sind Eigenschaften für die homogene neokortische Spezifizierung. Wir zeigen zudem, dass diese Eigenschaft in 2D (Rosetten) und 3D (organoids) Systemen, die mit der Triple-i Methode entwickelt worden, dramatisch stromlinienförmig gemacht wird. Dadurch verbinden wir Stammzelleigenschaften mit Zellpolarität in der kortischen Zellschicksalprozess unter Triple-i. Um diese Ergebnisse zu unterstützen, finden wir eine schwache notch Aktivierung und ihre Überschneidung mit radialer organistation in Systemen, die mit keiner Inhibition entwickelt worden. Dazu finden wir eine hohe notch Aktivierung in nicht radial organisierten Regionen, die nicht kortische Zellschicksale in Zellkulturen anreichern, die mit dual SMAD Inhibition entwickelt worden. Deswegen schlagen wir Folgendes vor: wenn diese Eigenschaften in Überschneidung zu sehen sind, können sie als eine zuverlässige Auslesung für eine effiziente kortische Differenzierung gelten. Um diesen Konzeptnachweis zu veranschaulichen, besonders im Forschungsgebiet der regenerativen Medizinforschung und ihrer Anwendungen, benutzten wir die Gehirnorganoidtechnologie als platform, neural Entwicklungsstörungen zu modellieren, insbesondere Mikrozephalie. Mikrozephalie ist eine genetisch heterogene kortische Entwicklungsstörung, die durch Abnormitäten im kortischen Entwicklungsprozess gekennzeichnet ist und zu einer kleineren Gehirngröße führt. Wir entwickeln mikrozephalische organoids von embryonischen Stammzellen von Menschen (hESCs) mit einer mutation im zentrosomischen Protein STIL. Diese organoids zeigen apoptosis in notch aktiv und radial organisierten Vesikel, Zell-Zyklus Arrest, frühzeitige Differenzierung und Verlust der Expression von kortisch spezifischen Genen, wenn diese von Triple-i Methoden entwickelt worden. Das zeigt eine kortisch spezifische Ätiologie, die nur in Triple-i organoids zu finden ist. Auf diese Weise beschließen wir, dass die Kombination von WNT Inhibition mit dual SMAD Inhibition für die Standardisierung der Modellierung von der Kortikogenese auf Gesundheit und Krankheit unverzichtbar ist.
