Die Retinol Saturase (RetSat) stellt einen neuen Regulator des hepatischen Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. Durch Beeinflussung der Aktivität des glukoseaktivierten Transkriptionsfaktors carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) in der Leber, ist die RetSat mit an der Aufnahme von Kohlenhydraten und dessen Umwandlung zu Lipiden beteiligt. Der zugrundeliegende Mechanismus ist bisher noch nicht bekannt. Jedoch scheint die egg laying defective nine homolog 3 (EGLN3), ein durch RetSat-reguliertes proteinmodifizierendes Enzym, die ChREBP-Aktivität durch potentielle Prolinhydroxylierungen maßgeblich zu beeinflussen.
Die vorliegende Arbeit soll zu einem erweiterten Verständnis der physiologischen Funktion der RetSat in der Leber beitragen und den zugrundeliegenden Mechanismus der RetSat-ChREBP-Interaktion aufdecken. Insbesondere die identifizierten Prolinhydroxylierungen im ChREBP sollen hinsichtlich einer regulatorischen Funktion untersucht werden. Im Rahmen dessen soll eine hepatische RetSat-Depletion in adipösen Mäusen untersucht und primäre Maushepatozyten für Translokationsstudien von endogenem ChREBP verwendet werden. Um eine Aussage über eine Relevanz der RetSat im Glukose- und Lipidstoffwechsel im Menschen zu treffen sollen humane Leberproben analysiert werden. Mittels zielgerichteter Mutagenese sollen die Prolinhydroxylierungen an Position 141 und 536 im ChREBP in verschiedenen Zelllinien (HEK293, AML12) untersucht werden. Zusätzlich soll eine neue konditionale RetSat knockout-Mauslinie generiert werden.
Die RetSat ist an der Entstehung einer hepatischen Steatose beteiligt. So führte eine RetSat-Depletion in adipösen Mäusen zur Reduktion des Leberlipidgehaltes und damit zur Verbesserung der durch Hochfettdiät-induzierten hepatischen Steatose. Außerdem zeigten Mäuse mit hepatischer RetSat-Depletion eine verbesserte Glukosetoleranz. In humanen Leberproben konnte zusätzlich eine positive Korrelation zwischen RETSAT-Expression und dem Schweregrad einer bestehenden Steatose sowie dem Body-Mass-Index gezeigt werden. Als Ursache für die verminderte ChREBP-Aktivität infolge einer RetSat-Depletion konnte, durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie von endogenem ChREBP, eine verminderte nukleäre Anreicherung in primären Maushepatozyten nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte die Prolinhydroxylierung an Position 141 und 536 im ChREBP als eine neue regulatorische posttranslationale Modifikation identifiziert werden. Die Substitution der Proline an Position 141 und 536 im ChREBP ließen eine eingeschränkte (P536) bzw. stark dezimierte (P141) ChREBP-Aktivität nachweisen. Die neue konditionale RetSat knockout-Mauslinie konnte erfolgreich generiert und die Funktionalität durch eine induzierte RetSat-Deletion in der Leber bereits bestätigt werden. Damit steht diese Mauslinie in Zukunft für Kurz- und Langzeitstudien einer RetSat-Deletion in beliebigen Organen zur Verfügung.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die verminderte ChREBP-Aktivität infolge einer RetSat-Depletion von EGLN3 abhängig ist. Durch eine RetSat-Depletion könnte die prolinhydroxylierende Eigenschaft der EGLN3 abgeschwächt sein, wodurch die ChREBP-Aktivität infolge fehlender Prolinhydroxylierungen an Position 141 und 536 vermindert ist. Da metabolische Erkrankungen, wie Diabetes mellitus Typ 2 und NAFLD, häufig mit einer verstärkten ChREBP-Aktivität in der Leber assoziiert sind, könnte eine Inhibition der hepatischen RetSat therapeutischen Nutzen zur Behandlung einer hepatischen Steatose, Dyslipidämien sowie einer Hyperglykämie haben.
Retinol Saturase (RetSat) is a new regulator of hepatic glucose and lipid metabolism. RetSat influences the activity of the glucose-activated transcription factor carbohydrate response element-binding protein (ChREBP) in the liver. Thus, RetSat is involved in the uptake of carbohydrates and their conversion into lipids. The underlying mechanism is not yet known. However, the egg laying defective nine homolog 3 (EGLN3), a protein-modifying enzyme regulated by RetSat, appears to significantly influence ChREBP activity through potential proline hydroxylations. The present work aims to contribute to a better understanding of the physiological functioning of RetSat in the liver and to uncover the underlying mechanism of RetSat-ChREBP interaction. In particular, the identified proline hydroxylations in the ChREBP will be investigated with respect to their regulatory function. In this context, a hepatic RetSat depletion in obese mice will be investigated and primary mouse hepatocytes will be used for translocation studies of endogenous ChREBP. Human liver samples will be analyzed to determine the relevance of RetSat in human glucose and lipid metabolism. Using targeted mutagenesis, proline hydroxylations of proline 141 and 536 in the ChREBP in different cell lines (HEK293, AML12) will be investigated. In addition, a new conditional RetSat knockout mouse line will be generated. RetSat contributes to the development of hepatic steatosis. RetSat depletion in obese mice led to a reduction in liver lipid content, and thus, to an improvement in hepatic steatosis caused by a high-fat diet. In addition, mice with hepatic RetSat depletion showed improved glucose tolerance. In human liver samples RETSAT expression is positively correlated to the degree of steatosis as well as the body mass index. Confocal fluorescence microscopy of endogenous ChREBP showed that the reduced ChREBP activity due to RetSat depletion was caused by the reduced nuclear translocation in primary mouse hepatocytes. In addition, proline hydroxylation on positions 141 and 536 in the ChREBP were identified as a new regulatory posttranslational modification. The substitution of Proline 141 and 536 in the ChREBP showed a limited (P536) or strongly decimated (P141) ChREBP activity. The new conditional RetSat knockout mouse line was successfully created as demonstrated by an induced RetSat deletion in the liver. Thus, this mouse line will be available for short- and long-term studies of a RetSat deletion in any organ. The results indicate that the decreased ChREBP activity due to RetSat depletion is dependent on EGLN3. RetSat depletion may attenuate the proline hydroxylating property of EGLN3, resulting in lower ChREBP activity due to lack of proline hydroxylation at positions 141 and 536. Since metabolic diseases such as diabetes mellitus type 2 and NAFLD are often associated with increased ChREBP activity in the liver, inhibition of hepatic RetSat may have therapeutic benefits in the treatment of hepatic steatosis, dyslipidemia and hyperglycemia.
