Human herpesvirus-6 (HHV-6) is a betaherpesvirus that has been classified as two distinct virus species, HHV-6A and HHV-6B, based on the differences in their biological and genetic characteristics. Primary infection with HHV-6B causes a febrile illness in children called roseola infantum (sixth disease), which is occasionally associated with neurological issues like seizures and encephalitis. The clinical aspects and epidemiology associated with HHV-6A infections are inadequately understood. Following primary infection the virus establishes a lifelong persistence in infected individuals, termed as latency. Both HHV-6A and -6B are known to integrate their genome into host telomeres of latently infected cells. When integration of the virus occurs in germ cells it results in individuals that harbor the integrated virus in each and every nucleated cell in their body. This condition is commonly termed as inherited chromosomally integrated HHV-6 (iciHHV-6) and is present in about 1 % of the global human population. Both HHV-6A/B can reactivate from latently infected cells, as well as in iciHHV-6 patients, and is associated with several clinical conditions including encephalitis and graft rejection following transplantation. Human cord blood mononuclear cells (CBMC) and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) provide efficient replication of HHV-6A and -6B. Various T-cell lines including JJHan and SupT1 cells are permissive to HHV-6A/B lytic replication as well. It is also interesting to note that the viruses can establish latency in these cell lines; however, it remains unknown how the decision between lytic replication and latency is made. In the target cells, after infection, the virus genome is confronted with the nuclear domain 10 (ND10) complex that possesses antiviral activity against a plethora of viruses. The three major constituents of the ND10 complex are namely, promyelocytic leukemia antigen (PML), speckled protein of 100kDa (Sp100) and human death domain-associated protein 6 (hDaxx). Numerous viruses belonging to the herpesviridae family encode proteins that have been shown to manipulate these components and disrupt the ND10 complex during the establishment of infection. For example, ICP0 of herpes simplex virus 1 (HSV-1) induces degradation of PML and Sp100. Similarly, the viral immediate early protein-1 (IE1) of human cytomegalovirus (HCMV) interacts with PML and induces dissociation of the ND10 complex. Additionally, HCMV pp71 induces degradation of hDaxx, which is an important step for productive HCMV gene expression. Majority of known human herpesviruses have been found to efficiently subvert the ND10 complex to establish a successful lytic infection in the host; however, the role of the ND10 complex in HHV-6 infection remains poorly understood. In this project I investigated the role played by the ND10 protein complex on the event of HHV-6A infection. Firstly, to determine the status of ND10 complex in HHV-6A infected cells I stained and checked for the status of PML (indicative of ND10 complex) in HHV-6A infected JJHan cells. Immunofluorescence studies revealed that ND10 bodies are not dissociated, but their number is reduced in lytically infected cells. To address the role of the ND10 complex, I knocked down the key constituents PML, Sp100 and hDaxx in HHV-6A permissive cells using shRNAs. Clonal cell lines were generated from the ployclonal knock down stock. In the follow up step I used the clonal KD10 knock down cells in an infection assay to determine the effect of the absence of ND10 constituents on viral replication. My data revealed that lytic replication of HHV-6A was significantly enhanced upon knockdown of the ND10 complex. Finally, I also investigated the effect of ND10 complex on suppression of viral gene expression. For this purpose I HHV-6A virus with a GFP tag on the late lytic gene U57 and infected ND10 knockdown cells. The data obtained clearly showed that viral gene expression was more efficient in cells upon knockdown of ND10 complex as compared to the parental cells. Taken altogether, my data provides the unique evidence that unlike other human herpesviruses HHV-6A replication within host cells are suppressed by the ND10 complex. Furthermore HHV-6A gene expression is also silenced because of the presence of the ND10 complex. Also, my study garners evidence of stronger lytic replication of HHV-6A in the absence of the ND10 complex, which provides a strong case for the ND10 complex as a key contributor towards HHV-6A latency.
Das Humane Herpesvirus 6 (HHV-6) ist ein Betaherpesvirus und wird in zwei Virusspezies, HHV-6A und HHV-6B, klassifiziert – basierend auf Unterschieden in biologischen und genetischen Eigenschaften. Eine Primärinfektion mit HHV-6 führt zu einem febrilen Infekt, der Kinderkrankheit Roseola Infantum (Sechste Krankheit), die gelegentlich mit Begleiterscheinungen wie neurologischen Störungen, Krämpfen und Enzephalitiden auftritt. Klinische Aspekte und die mit HHV-6 Infektionen einhergehende Epidemiologie sind bisher nur unzureichend bekannt. Nach einer Primärinfektion kann HHV-6 in infizierten Individuen in einem Ruhezustand verbleiben, welcher Latenz genannt wird. Für beide Viren (sowohl HHV-6A als auch HHV-6B) ist hinreichend bekannt, dass sie ihr Genom in die Telomere der latent infizierten Wirtszelle integrieren können. Findet diese Integration in der Keimbahn statt führt es dazu, dass das integrierte Virus in betroffenen Individuen in jeder zellkernhaltigen Körperzelle zu finden ist. Dieser Zustand wird als chromosomal integriertes HHV-6 (inherited chromosomally integrated HHV-6, iciHHV-6) bezeichnet und hat eine Prävalenz von circa 1% in der gesamten Weltbevölkerung. HHV-6A und HHV-6B können in latent infizierten Zellen und in iciHHV-6 Patienten reaktiviert werden und diese Reaktivierung ist mit einer Reihe von klinischen Ausprägungen inklusive Enzephalitis und Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen assoziiert. Mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut (human cord blood mononuclear cells, CBMC) und mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) erlauben eine effiziente Replikation von HHV-6A und HHV-6B. Genau wie verschiedene T-Zelllinien wie JJHan und SupT1. Interessanterweise kann das Virus auch in diesen Zellen eine Latenz etablieren, wobei ungeklärt ist, wie die Entscheidung zwischen lytischer Replikation und latenter Infektion getroffen wird. Nach Infektion der Zielzelle ist das Virus mit dem sogenannten ND10 (nuclear domain 10)-Komplex konfrontiert, ein intrinsischer antiviraler Abwehrmechanismus mit Aktivität gegen eine Vielzahl von Viren. Der ND10-Komplex besteht aus 3 Hauptkomponenten: promyelocytic leukemia protein (PML), human death associated protein (hDaxx) und speckled protein of 100 kDa (sp100). Viele Herpesviren codieren Proteine von denen gezeigt wurde, dass diese die ND10-Komponenten beeinflussen und so den ND10-Komplex während der Etablierung einer Infektion dissoziieren. Zum Beispiel induziert das Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) Protein ICP0 eine Degradation von PML und Sp100. Ähnlich interagiert auch das virale immediate early 1 Protein (IE1) des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) mit PML und induziert so eine Dissoziation des ND10-Komplexes. Zusätzlich induziert das HCMV-Protein pp71 eine Degradierung von hDaxx – ein wichtiger Schritt für eine produktive HCMV Genexpression. Für die Mehrzahl der bekannten humanen Herpesviren wurde beschrieben, dass diese den ND10-Komplex effektiv zersetzen können um eine lytische Replikation im Wirt zu ermöglichen. Dagegen ist die Rolle des ND10-Komplexes in der HHV-6 Infektion bisher unzureichend bekannt. In diesem Projekt habe ich untersucht, welche Rolle der ND10-Komplex in der HHV-6 Infektion spielt. Zuerst habe ich mittels Färbung von PML (stellvertretend für den ND10-Komplex) in HHV-6 infizierten JJHan Zellen den Status von ND10 in HHV-6 infizierten Zellen bestimmet. Immunofluoreszenzstudien konnten zeigen, dass ND10-Komplexe nicht dissoziieren, deren Anzahl in lytisch infizierten Zellen jedoch reduziert ist. Um die Rolle des ND10-Komplexes weiter zu untersuchen habe ich die Kernkomponenten PML, SPp100 und hDaxx in HHV-6 permissiven Zellen per shRNA ausgeschaltet (shRNA knockdown). Aus polyklonalen Zellen habe ich monoklonale Knockdown-Zelllinien generiert. Mit diesen klonalen ND10 Knockdown-Zellen habe ich in einem Infektionsassay den Effekt der ND10-Abwesenheit auf die Virusreplikation untersucht. Meine Daten zeigen, dass die lytische HHV-6 Replikation in den ND10 Knockdown-Zellen signifikant zunimmt. Zusätzlich habe ich den Effekt des ND10-Komplexes auf die Unterdrückung der viralen Genexpression untersucht. Hierfür habe ich ein HHV-6A Virus mit einer GFP-Markierung des späten lytischen Gens U57 benutzt um die ND10 Knockdown-Zellen zu infizieren. Die daraus resultierenden Daten zeigen eindeutig, dass die virale Genexpression in den ND10 Knockdown-Zellen effizienter ist als in den parentalen Zellen. Zusammenfassend geben meine Daten eindeutige Hinweise darauf, dass im Gegensatz zu anderen humanen Herpesviren die Replikation von HHV-6 in den Wirtszellen vom ND10-Komplex unterdrückt wird. Zusätzlich wird die HHV-6 Genexpression durch die Präsenz des ND10-Komplexes ausgeschaltet. Außerdem zeige ich mit dieser Studie eine stärkere lytische HHV-6 Replikation in Abwesenheit des ND10-Komplexes, ein deutlicher Hinweis dafür, dass der ND10-Komplex entscheidend zur HHV-6 Latenz beiträgt.
