dc.contributor.author
Strehle, Michael
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:26:54Z
dc.date.available
2004-11-30T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2552
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6753
dc.description
0 Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Der Met-Rezeptor und sein Ligand HGF/SF 1
1.1.1 Struktur 1 1.1.2 Signaltransduktion am Met-Rezeptor 3
1.2 Das Adaptorprotein Gab1 5
1.3 Das Met-Signalsystem in der Embryonalentwicklung und im adultem Organismus
6
1.4 Met und HGF/SF in menschlichen Erkrankungen 7
1.5 Entwicklung der Skelettmuskulatur in Wirbeltieren 9
1.6 Konditionelles Gene-Targeting 12
1.7 Ziel der vorliegenden Arbeit 14
2 Material und Methoden 15
2.1 Material 15
2.1.1 Bakterienstämme 15
2.1.2 Vektoren 15
2.1.3 Antikörper 16
2.1.4 Genomische Klone 16
2.1.5 ES Zellinien 16
2.1.6 Mausstämme 16
2.1.7 Nährmedien 17
2.1.8 Zellkulturmedien 17
2.2 Methoden 18
2.2.1 Isolierung von Desoxyribonukleinsäuren 18
2.2.1.1 Präparation von Plasmid-DNA und DNA-Fragmenten 18
2.2.1.2 Isolierung genomischer DNA aus ES-Zellen 18
2.2.1.3 Isolierung genomischer DNA aus embryonalem Gewebe, Ohrlöchern bzw.
Schwanzstücken 19 2.2.2 Restriktionsverdaue von Desoxyribonukleinsäuren und
Transformation kompetenter Bakterien 19
2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 19
2.2.4 Sequenzierung 23
2.2.5 Radioaktive Markierung von Desoxyribonukleinsäuren 24
2.2.6 Synthese Digoxigenin-markierter in vitro-Transkripte 24
2.2.7 Southern-Hybridisierung 24
2.2.8 Zellkultur 25
2.2.8.1 Präparation und Kultur primärer embryonaler Fibroblasten 25
2.2.8.2 Kultur, Transfektion und Selektion embryonaler Stammzellen 26
2.2.9 Etablierung von "Knockout"-Mäusen 27
2.2.9.1 Superovulation und Isolierung von Blastozysten 28
2.2.9.2 Injektion embryonaler Stammzellen in Blastozysten 28
2.2.9.3 Uterustransfer von Blastozysten 29
2.2.10 Histologische Methoden 29
2.2.10.1 Herstellung von Gefrierschnitten 29
2.2.10.2 Histologische Färbung für b-Galaktosidase 30
2.2.10.3 Histologische Färbung für Alkalische Phosphatase 30
2.2.10.4 Immunhistologie auf Gewebeschnitten 31
2.2.10.5 Detektion von Zellproliferation und Apoptosen 31
2.2.10.6 Herstellung von Vibratomschnitten 32
2.2.11 In situ-Hybridisierung 32
2.2.11.1 Whole Mount in situ-Hybridisierung 32
2.2.11.2 Präparation von Embryo-Pulver 34
2.2.12 Proteinchemische Methoden 34
2.2.12.1 Herstellung von Gewebehomogenisaten für den Proteinnachweis 34
2.2.12.2 Immunopräzipitation aus Gewebelysat 35
2.2.12.3 Bestimmung des Proteingehalts 35
2.2.12.4 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese von Proteinen 35
2.2.12.5 Western-Blotting-Transfer von Proteinen auf Nitrocellulosemembran 36
2.2.12.6 Immunodetektion von Proteinen auf Nitrocellulosemembran 36
2.2.12.7 Kinase-Assay 36
2.3 Konstruktion der Targeting Vektoren 37
2.3.1 Konstruktion des metflox-Allels 37
2.3.2 Konstruktion des otx1Cre-Allels 39
2.3.2.1 Isolierung des genomischen otx1-Lokus 39
2.3.2.2 Mutagenese des PGKCrebpA Vektors 39
2.3.2.3 Klonierung des otx1Cre-Targeting-Vektors 40
3 Ergebnisse 42
3.1 Konditionelle Mutagenese des Met-Gens 42
3.1.1 Klonierung des metflox Targeting-Vektors 42
3.1.2 Homologe Rekombination des metflox Targeting-Vektors in embryonalen
Stammzellen und Etablierung der metfloxneo Mauslinie 45
3.1.3 Vorversuche zu Aktivität und induzierter Inaktivierung des metfloxneo-
Allels 45
3.1.4 Phänotyp des metfloxneo-Allels 47
3.1.5 Entfernung der Neomycin-Resistenzkassette aus dem metfloxneo Locus 47
3.1.6 Phänotyp des metflox-Allels 48
3.2 Funktion von Met in der Entwicklung migratorischer Muskelvorläuferzellen
49
3.2.1 Delamination von Muskelvorläuferzellen in Mutanten des Met-Signalsystems
50
3.2.2 Defekte in der Myogenese bei Gab1-/-//Met+/- Embryonen 51
3.2.3 Schicksal der Muskelvorläuferzellen in Gab1-/-//Met+/- Doppelmutanten 52
3.3 Konstruktion des otx1Cre-Transgens 56
3.3.1 Isolierung des genomischen otx1-Lokus 58
3.3.2 Mutagenese des PGKCrebpA Vektors 58
3.3.3 Klonierung des otx1Cre Targeting-Vektors 59
3.3.4 Homologe Rekombination des otx1Cre Targeting-Vektors in embryonalen
Stammzellen und Etablierung der transgenen Mauslinie 59
3.3.5 Überprüfung der Cre-Rekombinaseaktivität in vivo durch Reporterallel 60
3.3.6 Einkreuzen eines optimierten Flp-Deleter Allels 61
3.3.7 Analyse der Cre-Rekombinaseaktivität in vivo durch Reporterallele 61
4 Diskussion 64
4.1 Etablierung des konditionellen metflox Allels 64
4.2 Rolle des Met-Signalsystems in der Wanderung von Muskelvorläuferzellen 67
4.3 Etablierung des otx1Cre Transgens 72
5 Zusammenfassung 76
6 Literaturverzeichnis 78
dc.description.abstract
Der Tyrosinkinaserezeptor Met und sein Ligand HGF/SF übernehmen wichtige
Funktionen in der Embryonalentwicklung der Maus. Tiere mit einer Nullmutation
des Rezeptors sterben in utero. Sie weisen Defekte in der Entwicklung von
Leber und Plazenta auf, zudem ist die Wanderung von migratorischen
Muskelvorläuferzellen aus dem Dermomyotom in Extremitäten, Zwerchfell und
Zunge gestört. Um die embryonale Letalität der Met-Nullmutation zu überwinden,
wurde unter Verwendung des Cre/loxPSystems ein konditionelles Met Allel in der
Maus etabliert. Das metflox-Allel stellt einen knock-in der humanen Met cDNA
in den murinen Met Locus dar. Das hybride Rezeptor besteht aus extrazellulärer
und Transmembran-Domäne des murinen sowie intrazellulärer Domäne des humanen
Met. Der Rezeptor ist aktiv, und das metflox-Allel kann durch Cre-Expression
in vivo deletiert werden. Beobachtungen an heterozygoten Tieren mit einem
metflox/- Genotyp deuten allerdings darauf hin, daß das metflox-Allel die
Signalaktivität des Wildtypallels nicht vollständig erreicht. Delamination und
Wanderung von migratorischen Muskelvorläuferzellen wurde in
Kombinationsmutanten mit dem Genotyp Gab1-/-//Met+/- eingehender analysiert.
In diesen Mutanten ist das Met-Signal im Vergleich zu Gab1-/- Mutanten weiter
abgeschwächt und erlaubt so Rückschlüsse auf die Funktion von Met während der
Wanderung der Muskelvorläuferzellen. In Gab1-/-//Met+/- Tieren delaminieren
die Vorläuferzellen zwar, sie aggregieren jedoch häufig und migrieren nur sehr
bedingt. Falsch positionierte Vorläuferzellen werden durch Apoptose
eliminiert. Die Proliferation der Zellen ist geringfügig beeinträchtigt, und
Differenzierung der wenigen ausgewanderten Vorläuferzellen zu Muskelzellen
findet statt. Um das konditionelle metflox-Allel im Gehirn deletieren zu
können, wurde ein ZNSspezifisches Cre-Transgen etabliert, bei dem Cre unter
Kontrolle des endogenen Otx1 Promotors steht. Die Analyse des otx1Cre-
Transgens mit einem Reporterallel zeigt spezifische Rekombinaseaktivität in
Vorder- und Mittelhirn sowie ektopische Aktivität im kaudalen Mesenchym,
Epidermis sowie punktuelle Aktivität im Herzen. Bei etwa 25% der Tiere wird
ubiquitäre Rekombinaseaktivität beobachtet, was auf einen homozygot vererbten
Modifikator der otx1Cre-Expression hindeutet.
de
dc.description.abstract
The receptor tyrosine kinase Met and its ligand HGF/SF play an important role
in mouse embryonic development. Null mutations of Met are embryonic lethal
with severe defects in liver and placental development. Directed migration of
muscle precursor cells into the anlagen of limbs, diaphragm and tongue is
impaired. To escape embryonic lethality, a conditional null allele was
established by means of Cre/loxP technology. In the metflox allele, human Met
cDNA was introduced into the mouse Met locus, thus creating a hybrid knock-in
allele. The hybrid receptor is comprised of murine extracellular and
transmembrane domain and human intracellular domain. The receptor is active,
and the metflox allele can be deleted by expressing Cre rekombinase in vivo.
Yet, reduced vitality of heterozygous metflox/- animals seems to indicate that
signaling activity of the hybrid metflox receptor does not entirely meet that
of wildtype Met receptor. Compund mutants with a Gab1-/-//Met+/- genotype were
used to study delamination and migration of migratory muscle precursor cells.
Met signalling is further attenuated in these compounds mutants as compared to
Gab1-/- mutants; this allows one to analyze Met function during migration of
muscle precursor cells. Muscle precursor cells do delaminate in
Gab1-/-//Met+/- animals, but they tend to aggregate and are rarely seen to
migrate. Ectopically positioned cells are eliminated by apoptosis. Cell
proliferation is moderately reduced, and muscle precursors that actually
managed to migrate to their target sites differentiate into muscle cells. In
order to inactivate the conditional metflox allele selectively in the brain, a
CNS specific Cre transgene was established that carries Cre under control of
the endogenous Otx1 promotor. Analysis of otx1Cre activity with a reporter
allele shows specific recombinase activity in fore- and midbrain.
Additionally, ectopic recombinase activity is observed in caudal mesenchyme,
epidermis and parts of the heart. About 25% of all analyzed animals show
ubiquitious Cre activity, indicating an inheritable genetic modifier of
otx1Cre expression.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
muscle development
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Die Rolle des Met-Signalübertragungssystems bei der Muskelentwicklung in der
Maus
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Carmen Birchmeier
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Fritz G. Rathjen
dc.date.accepted
2004-11-23
dc.date.embargoEnd
2004-12-15
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2004003103
dc.title.translated
Role of the Met signaling system in muscle development of the mouse
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001402
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2004/310/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001402
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access
