Einleitung: Trotz wissenschaftlicher Fortschritte stellt die Transplantat-gegen-Rezipient Erkrankung (engl. graft-versus-host-disease, GvHD) eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität nach der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (alloHSZT) dar. Die Gabe von Antithymozytenglobulin aus Kaninchen (rATG) bietet eine Möglichkeit, GvHD nach einer alloHSZT zu reduzieren. Allerdings werden eine durch rATG hervorgerufene verzögerte Immunzellrekonstitution sowie eine daraus folgende erhöhte Infektanfälligkeit diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wird die Fragestellung untersucht, ob die rATG Präparate Grafalon und Thymoglobulin eine Zytotoxizität gegenüber humanem Thymusgewebe aufweisen und damit die T-Zell Rekonstitution nach einer alloHSZT möglicherweise negativ beeinflussen. Methoden: Zunächst wurden zur Etablierung einer humanen Thymusstromzellkultur zwei Ansätze zur Kultivierung von humanen Thymusstromazellen untersucht und der Anteil an Thymusepithelzellen mittels Durchflusszytometrie und Immunzytologie ermittelt. Es wurde die Bindung der beiden rATG Präparate an humane Thymusstromazellen und insbesondere an Thymusepithelzellen mittels Durchflusszytometrie und immunhistologischer Färbungen überprüft sowie deren komplementabhängige und -unabhängige Zytotoxizität ermittelt. Durch den Pan-Caspaseinhibitor Q-VD-OPh Hydrat wurde der Apoptosemechanismus durch die beiden rATG Präparate genauer untersucht. Weiterhin wurde die Expression ausgewählter Oberflächenantigene auf der Jurkatzelllinie, frischen humanen Thymozyten und humanen Thymusstromazellen charakterisiert. Ergebnisse: Die beiden Kulturansätze zeigten unterschiedliche Anteile an EpCAM+ Thymusepithelzellen: der serumhaltige Ansatz wies maximal 5% an EpCAM+ Zellen auf, in der serumfreien Kultur konnten bis zu >50% EpCAM+ Zellen erreicht werden. Beide rATG Präparate zeigten eine vergleichbare, dosisabhängige Bindung an humane Thymusstromazellen. Weiterhin wiesen beide rATG Präparate eine dosisabhängige, weitgehend Komplement-unabhängige Zytotoxizität gegenüber humanen Thymusstromazellen auf. Die durch die beiden rATG Präparate induzierte Apoptose konnte nicht mittels eines Pan-Caspaseinhibitor unterdrückt werden. Bei der Suche nach möglichen gemeinsamen Bindungsepitopen der zu untersuchenden Thymusstromazellen und der für die Produktion der rATG Präparate wichtigen Jukatzellen bzw. Thymozyten, konnten CD31, CD90 und HLA-DR auf Jurkatzellen und humanen Thymusstromzellen sowie CD31 und HLA-DR auf frischen humanen Thymozyten und humanen Thymusstromazellen als gemeinsame Oberflächenmarker identifiziert werden. Schlussfolgerung: Beide rATG Präparate zeigen vergleichbare zytotoxische Effekte auf humane Thymusstromazellen und könnten somit die thymusabhängige T-Zell Rekonstitution nach alloHSZT negativ beeinflussen. Folglich unterstützen unsere Daten für den Klinikalltag eine Kombination von rATG mit Thymus-protektiven Therapiemöglichkeiten (z.B. IL-7 und Keratinozyten-Wachstumsfaktor), um eine suffiziente GvHD Prophylaxe zu ermöglichen und gleichzeitig eine verzögerte T-Zell Rekonstitution zu vermeiden.
Introduction: Even though significant progress has been made, graft-versus-host disease (GvHD) still remains one of the most common causes for morbidity and mortality after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT). Rabbit anti-thymocyte globulin (rATG) represents one possibility for reducing GvHD after alloHSCT. However, a delayed immune reconstitution and consequently, higher rates of infection following rATG treatment are being discussed. In the following investigation, we examined two commonly used rATG preparations, Grafalon and Thymoglobulin, in respect to their cytotoxic effects on human thymic stroma cells and therewith on proper T cell reconstitution after alloHSCT. Methods: First, two different cell culture conditions were established and evaluated via flow cytometry and immunocytology regarding their amount of thymic epithelial cells. Moreover, the binding of both rATG preparations to human thymic stroma cells was compared by flow cytometry analysis and immunohistology stainings. Complement-dependent and -independent cytotoxicity of both rATG preparations towards human thymic stroma cells were assessed by flow cytometry analysis. The apoptosis mechanism was further analyzed by introducing the pan-caspase-inhibitor Q-VD-OPh hydrate. Additionally, we investigated the expression of selected antigens on the Jurkat cell line, fresh human thymocytes and cultured human thymic stroma cells. Results: Within the compared cell culture systems, EpCAM+ human thymic epithelial cells developed differently. Whereas the serum-containing approach contained a maximum of 5% EpCAM+ thymic epithelial cells, the serum-free approach showed a fraction of up to 50%. Both rATG preparations showed a comparable dose-dependent binding to human thymic stroma cells. Both rATG preparations exerted a mostly complement-independent and dose-dependent cytotoxicity towards human thymic stroma cells. rATG-induced apoptosis could not be inhibited by a pan-caspase-inhibitor. A number of antigens are expressed on both Jurkat cells (CD31, CD90, HLA-DR) and cultured human thymic stroma cells or fresh thymocytes (CD31, HLA-DR) and cultured human thymic stroma cells. Conclusion: Both rATG preparations exert similar cytotoxic effects on human thymic stroma cells, thus possibly hampering the thymus-dependent T cell reconstitution after alloHSCT. Consequently, our data supports a combined treatment of rATG and exogenous thymus-protective strategies (e.g. IL-7, keratinocyte growth factor), in order to simultaneously overcome delayed T cell reconstitution and offer sufficient GvHD prophylaxis.
