Einleitung:
Der Schlaganfall gilt als eine der führenden Todesursachen in der Bundesrepublik Deutschland. Die insuffiziente Versorgung der Zellen mit Sauerstoff und Glukose führt zur Aktivierung verschiedenster, hoch komplexer Signalwege. Unter anderem kommt es bei Substratdeprivation zur Induktion des programmierten Zelltodes, der Apoptose. In Studien konnte in diesem Zusammenhang die Schlüsselrolle eines Enzyms der Glykolyse, der Hexokinase II, hinsichtlich ihres protektiven Einflusses auf das Hirngewebe gezeigt werden (Mergenthaler et al., 2012). Die antiapoptotische Wirkung wird dabei durch einen Multiproteinkomplex der äußeren Mitochondrienmembran vermittelt. Als einer der Interaktionspartner der Hexokinase II konnte unter anderem das Protein Pea15 (phosphoprotein Enriched in Astrocytes, 15 kDa) erfasst werden (Mergenthaler et al., 2012). Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Etablierung der Co-Immunpräzipitation mit GFP- und RFP-Trap zum Nachweis von Proteininteraktionen. Damit sollte ein Immunpräzipitation- basiertes Screening von Hexokinase II- und Pea15-Mutanten ermöglicht und der Einfluss strukturell und funktionell wichtiger HKII- und Pea15-Domänen auf die Interaktion der beiden Proteine untersucht werden. Als Alternativmethodik wurde das proximity ligation assay (PLA-) basierte Screening von Hexokinase II- und Pea15-Mutanten in Zellkulturen herangezogen.
Methodik:
Die zu untersuchenden Interaktionspartner wurden in HeLa-Zellen (humane Epithelzellen eines Zervixkarzinoms) mittels Elektroporation (Nucleofection™) überexprimiert. Dabei wurden die transfizierten Gene an Fluoreszenzproteine gekoppelt. Über den Pulldown dieser mittels GFP- beziehungsweise RFP-Trap war es möglich, die zu untersuchenden Interaktionspartner im Western Blot darzustellen. Für die Durchführung des PLA wurden in funktionell und strukturell wichtigen HKII- und Pea15-Domänen punktmutierte Proteine in humanen embryonalen Nierenzellen überexprimiert.
Über die mit der Blobfinder-Software ausgewerteten Interaktionshäufigkeiten der Proteine in den Zellen nach Durchführung des PLA war ein Vergleich zwischen den untersuchten Mutanten und den wildtypischen Proteinen möglich.
Ergebnisse:
In der vorliegenden Arbeit gelang der Nachweis einer Interaktion von HKII und Pea15 unter Anwendung der RFP-Trap.
Schlussfolgerung:
Ein Immunpräzipitation-basiertes Screening von Hexokinase II- und Pea15-Mutanten ist auf der Grundlage der in der vorliegenden Arbeit etablierten Untersuchungsbedingungen möglich. Hinsichtlich des PLA-basierten Screenings ist die Durchführung weiterer Experimente zur Optimierung der experimentellen Bedingungen notwendig.
Introduction:
Stroke is one of the leading causes of death in Germany. An insufficient supply of oxygen and glucose in the cells leads to various, highly complex signal transmissions. Among other things substrate deprivation leads to the induction of programmed cell death, apoptosis. Studies in this respect have shown the key role of Hexokinase II, an enzyme in glycolysis, in the brain tissue with regard to its protective influence (Mergenthaler et al., 2012). The anti-apoptotic effect is mediated by a multiprotein complex of the outer mitochondrial membrane. The protein Pea15 (phosphoprotein Enriched in Astrocytes, 15 kDa) was detected as one of the interactional partners of Hexokinase II (Mergenthaler et al., 2012). The objective of this study was to establish the co-immunoprecipitation with GFP- and RFP-Trap for the detection of protein interactions. An immunoprecipitation-based screening of Hexokinase II and Pea15 mutants should exhibit the influence of structurally and functionally important HKII and Pea15 domains for the interaction of the two proteins. The proximity ligation assay-(PLA-)based screening of Hexokinase II and Pea15 mutants was used as an alternative method to investigate these interactions in cell cultures.
Methods:
Interactional partners in question were overexpressed in HeLa-cells (human epithelial cells of cervical cancer) by electroporation (Nucleofection™). The transfected genes of interest were coupled to fluorescent proteins. With the use of this method, it was possible to examine the interactional partners using GFP or RFP-Trap display in Western Blot. Functionally and structurally important HKII- and Pea15 point-mutated protein domains were overexpressed in human embryonic kidney cells for the implementation of the PLA. After performing the PLA, Blobfinder software was used to show interaction frequencies of the proteins in the cells, a comparison between the analyzed mutants and the wild-type proteins was possible.
Results:
It was possible to detect an interaction of HKII and Pea15 using the RFP-Trap in the present work.
Conclusion:
Based on the examination conditions put forth in this paper it is feasible to do an immunoprecipitation-based screening of Hexokinase II and Pea15 mutants. Further experiments are necessary to optimize experimental conditions to carry out the PLA- based screening.
