Einleitung: Durch das chronische Einwirken verschiedenster Noxen kann eine Leberfibrose bzw. -zirrhose entstehen. Hauptmotor der überschießenden Matrixproduktion sind die Hepatischen Sternzellen (HSZ), welche durch die chronische Schädigung aktiviert werden, zu Myofibroblasten transdifferenzieren und verstärkt Kollagen I (KI) synthetisieren. Dies führt zu einer veränderten Matrixzusammensetzung, wobei Kollagen IV und VI (KVI) den prozentual höchsten Anstieg erfahren. Methodik: Das Kollagen VI-Fragment (KVI-F) wurde durch Pepsinverdau aus humanen Plazenten isoliert und mittels Reduzierung und Alkylierung in seine drei alpha-Einzelketten fragmentiert. Mittels Hydroxyapatit-Chromatographie und Ionenaustauschchromatographie konnten die alpha-Einzelketten von KVI-F isoliert werden. Diese wurden im Gemisch, alleine sowie mit und ohne KVI-F in Zellkulturstudien an der Rattenzelllinie CFSC eingesetzt. Synthetisierte überlappende Peptide aus der Aminosäuresequenz der alpha3-Einzelkette von KVI-F (α3(VI)) wurden ebenfalls in Zellkulturstudien eingesetzt, um funktionelle Abschnitte in der Aminosäuresequenz der Einzelkette zu identifizieren. Die Proliferation der Zellen wurde durch Detektion des Einbaus von [³H]-Thymidin bestimmt. Bei Inhibitionsversuchen gegenüber KVI-F wurden die Zellen 1h vor KVI-F-Zugabe mit den isolierten Einzelketten vorinkubiert. Effekte von KVI-F und der überlappenden Peptide wurden mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion bestimmt. Ergebnisse: Zunächst konnte gezeigt werden, dass eine lagerungsbedingte Abnahme der biologischen Aktivität von KVI-F durch Denaturierung und Rückfaltung wiederhergestellt werden kann. Die bereits bekannten mitogenen Effekte von KVI-F in anderen Zelltypen konnten hier auch in CFSC gezeigt werden. Die Proliferationsinduktion durch KVI-F ließ sich durch Co-Behandlung mit 2-4-fachen molaren Überschüssen der alpha-Einzelketten hemmen, am stärksten durch α1(VI)- und α3(VI). Für α3(VI) konnten durch analoge Versuche mit überlappenden Peptiden funktionelle Motive auf den Peptiden A3, A4 und C2 identifiziert werden. In Genexpressionsstudien konnten alle drei Einzelketten von KVI-F, die KVI-F-induzierte Genexpression der Fibrosemarker KI, TGF-β und αSMA, signifikant senken. Zudem wurde die Expression des während der Fibrose von HSZ vermehrt synthetisierten TIMP-1 durch die Einzelketten signifikant gesenkt.
Schlussfolgerung: Die KVI-F Untereinheiten können nicht nur die durch KVI-F selbst induzierte Proliferation von HSZ inhibieren, sondern interferieren auch mit der Fibrose-typischen Synthese von Matrixbestandteilen (KI), para- und autokrin wirkenden Wachstumsfaktoren (TGF-β), Zellstrukturproteinen (αSMA) sowie Kollagenaseinhibitoren (TIMP-1). Als Mechanismus denkbar wäre eine Blockade der Aggregation des KVI-Rezeptors durch KVI-Primärstrukturen, diese Frage bedarf aber gezielter Studien. Die Ergebnisse dieser Arbeit eröffnen die rationale Möglichkeit, aus KVI abgeleitete Oligopeptide oder Peptidanaloga zu nutzen, um die mitogene Funktion von KVI-F während der hepatischen Fibrogenese zu blockieren und sollte perspektivisch in spezifischen Organmodellen realisiert werden.
Introduction: Due to the chronic effects of various noxae, liver fibrosis and cirrhosis can occur. Amongst other cell types, hepatic stellate cells (HSC) are central effectors during liver fibrogenesis. They get activated and transdifferentiate to myofibroblasts which mainly synthesize collagen I (CI). This results in a modified matrix composition, in which the percentage increase of collagen IV and VI (CVI) is the highest. Methodology: Collagen-VI-fragment (CVI-F) was isolated by pepsin digestion from human placentas. It consists of three alpha-single chains which were obtained by reduction and alkylation of CVI-F. Further, overlapping peptides based on the amino acid sequence of the alpha3-single chain (α3(VI)) were synthesized. Cell culture studies were performed using a rat-derived HSC cell line (CFSC). Effects on proliferation were determined by incorporation of [³H]-thymidine. To determine inhibitory effects of the single chains and the peptides against CVI-F, the cells were 1 h preincubated before addition of CVI-F. Effects on gene expressions were determined by quantitative polymerase chain reaction. Results: A storage-dependent decrease of the biological activity of CVI-F could be restored by denaturation and refolding of the peptide. In vitro, CVI-F induced a concentration-dependent proliferation in CFSC confirming the already known mitogenic effects of CVI-F in other cell types. These effects of CVI-F were blocked by co-treatment with a 2-4-fold molar excess of the alpha-single chains. Here, a1(VI) and a3(VI) showed the strongest inhibitory activity. The α3(VI)-derived overlapping peptides as well interfered with CVI-F-induced proliferation of CFSC. The peptides A3, A4 and C2 showed the strongest effects. Besides proliferation, the individual alpha single chains significantly reduced the CVI-F-induced expression of the fibrosis-associated genes CI, TGF-β and αSMA and vice versa induced the expression of TIMP-1, which was downregulated by CVI-F. The strongest effects were observed for α2(VI) and α3(VI). Conclusions: The profibrotic effects of CVI-F could be blocked by CVI-F-derived alpha single chains and α3(VI)-derived peptides. Besides proliferation, the CVI-F subunits interfere with the synthesis of matrix constituents (CI), para- and autocrine-acting growth factors (TGF-β), cell structure proteins (αSMA) and inhibitors of collagenases (TIMP-1). This might be due to a blockade of the aggregation of the CVI receptor by CVI primary structures. The data of the present study imply the possibility of using CVI derived oligopeptides or peptide-analoga to block the promoting effects of CVI-F in liver fibrosis. This should be further studied in suitable organ models of fibrosis.
