Einleitung: Hinsichtlich einer Assoziation zwischen dem Humanen Cytomegalievirus (HCMV) und dem kolorektalen Karzinom ist die Studienlage kontrovers. HCMV, ein ubiquitäres Pathogen, hat zwecks Begünstigung seiner Vermehrung intrazelluläre Strategien zur Nutzung des Wirtsstoffwechsels entwickelt. Bisherige Forschungsergebnisse konnten diesbezüglich zeigen, dass der Proteasominhibitor MG132 die Replikation von HCMV bei den Fibroblasten inhibiert. Ziel dieser Arbeit ist es, die Wirkung des spezifischen Proteasominhibitors Bortezomib auf die HCMV-Replikation sowie apoptotische/nekrotische Effekte in Gegenwart von HCMV und/oder Bortezomib bei der Kolonkarzinomzelllinie Caco-2 zu überprüfen. Methoden: Für den Nachweis der Permissivität von Caco-2 für HCMV wurde die Expression des sehr frühen (IE1), frühen (pUL44) und späten (pp28) viralen Proteins mittels indirekter Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie analysiert. Zur Überprüfung des Einflusses der Ko-Kultur und Ko-Infektion auf die Caco-2-HCMV-Infektion diente der Plaquereduktionsassay. Desgleichen erfolgte die Prüfung der antiviralen Wirkung von Bortezomib und (S)-MG132 (Kontrolle), verifiziert anhand der Durchflusszytometrie sowie indirekten Immunfluoreszenz. Zytotoxische Nebeneffekte konnten durch den Selektivitätsindex detektiert werden. Unter Verwendung von Durchflusszytometrie, JC-1-Assay, Cell Death Detection ELISAPlus oder Western-Blot wurden apoptotische/nekrotische Effekte bei den nichtinfizierten und infizierten Caco-2-Mono- und Ko-Kulturen nach zeitabhängiger Behandlung mit serumarmen Medium und Bortezomib untersucht. Experimente zum Proliferationsverhalten erfolgten dementsprechend mithilfe des Trypanblau-Ausschlusstests. Ergebnisse: Durch den Nachweis aller viralen Proteine, einschließlich Strukturproteine, konnte die Permissivität von Caco-2 für HCMV bewiesen werden. Die antivirale Aktivität beider Proteasominhibitoren war vermutlich mit zytotoxischen Nebeneffekten zu begründen. Der durch HCMV zunächst induzierte geringe proapoptotische Effekt bei den Caco-2 wurde im zeitlichen Verlauf antiapoptotisch. Zudem stabilisierte HCMV vermutlich frühzeitig das mitochondriale Membranpotential, welches die proapoptotische Wirkung von Bortezomib blockierte. Bei den nichtinfizierten Caco-2 zeigte Bortezomib einen leichten antiapoptotischen Effekt. Bei 7-tägiger Exposition bewirkte Bortezomib sowohl bei den nichtinfizierten als auch bei den infizierten Caco-2 einen leichten zytotoxischen Effekt, welcher durch die Ko-Kultur ebenso vermindert wurde. Die Ko-Infektion der Tumorzellen mit HCMV-infizierten Fibroblasten führte zu hohen Infektionsraten nichtvorbehandelter Caco-2, wobei ein zellzahl- sowie titerabhängiger zytopathischer Effekt oder eine Proliferationssteigerung wahrscheinlich waren. Schlussfolgerung: HCMV wirkte im zeitlichen Verlauf bei den Caco-2, bei unveränderten Zellumgebungsbedingungen, gering antiapoptotisch. Bortezomib induzierte einen leichten antiapoptotischen Effekt, der vermutlich zusätzlich HCMV-abhängig war. Die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität des 26S-Proteasoms schien somit essentiell für die HCMV-Replikation bei den Zellen zu sein. Die bei längerer Exposition insgesamt bei den Caco-2 induzierte leichte zytotoxische Wirkung von Bortezomib wurde durch die Ko-Kultur gleichermaßen vermindert.
Introduction: The available evidence for an association between human cytomegalovirus (HCMV) and colorectal carcinoma is controversial. The ubiquitous pathogen HCMV has developed intracellular strategies for exploiting the host metabolism to promote its reproduction. Existing Research results show that the proteasome inhibitor MG132 inhibits the replication of HCMV in fibroblasts. The aim of this study is to evaluate the effect of the specific proteasome inhibitor bortezomib on HCMV replication as well as apoptotic/necrotic effects in the presence of HCMV and/or bortezomib in the colorectal carcinoma cell line Caco-2. Methods: To establish the HCMV permissiveness of Caco-2, the expression of the immediate early (IE1), early (pUL44) and late (pp28) viral protein was analysed by indirect immunofluorescence and flow cytometry. A plaque reduction assay served to determine the influence of co-culture and coinfection on Caco-2 HCMV infection. The antiviral effect of bortezomib and (S)-MG132 (control) was also investigated and verified by flow cytometry and indirect immunofluorescence. Cytotoxic side effects were detected by the selectivity index. Using flow cytometry, JC-1 assay, Cell Death Detection ELISAPlus or Western blot analysis, apoptotic/necrotic effects in uninfected and infected Caco-2 monocultures and co-cultures were compared following time-dependent treatment with low-serum medium and bortezomib. Experiments on proliferation behaviour were conducted using the trypan blue exclusion test. Results: HCMV permissiveness of Caco-2 was proven by detection of all viral proteins, including structural proteins. The antiviral activity of both proteasome inhibitors was likely due to cytotoxic side effects. The slight proapoptotic effect initially induced by HCMV in Caco-2 became antiapoptotic in the further course. Additionally, HCMV likely stabilized the mitochondrial Membrane potential early, which blocked the proapoptotic effect of bortezomib. In uninfected Caco-2, bortezomib exhibited a slight antiapoptotic effect. After 7-day exposure, bortezomib had a slight cytotoxic effect in uninfected and infected Caco-2, which was also reduced by co-culture. Co-infection of tumour cells with HCMV-infected fibroblasts led to high infection rates of non-pretreated Caco-2, with a likely cell-count-dependent and titre-dependent cytopathic effect or proliferation increase. Conclusion: Over time, under unchanged ambient conditions, HCMV had a slight antiapoptotic effect on Caco-2. Bortezomib induced a slight antiapoptotic effect, which was likely additionally HCMV-dependent. The chymotrypsin-like activity of the 26S proteasome therefore appeared essential for HCMV replication in the cells. The slight cytotoxic effect of bortezomib induced in Caco-2 following longer-term exposure was equally reduced by co-culture.
