EINLEITUNG. Ischämisch-neovaskuläre Retinopathien (u.a. Frühgeborenenretinopathie oder diabetische Retinopathie) sind die häufigste Erblindungsursache in Industrienationen und stellen somit eine Herausforderung für die Augenheilkunde dar. Der Einsatz von anti-VEGF-A-Antikörpern hat die Therapie revolutioniert, jedoch profitieren nicht alle Patienten davon. Interessanterweise reduziert eine Makrophagendepletion im Modell der Sauerstoff-induzierten Retinopathie (einem Tiermodell der Frühgeborenenretinopathie) pathologische retinale Neovaskularisation. Daher wurde bisher das von Makrophagen synthetisierte VEGF-A als pathophysiologisch relevante Quelle pro-angiogener Stimuli vermutet. Ziel dieser Arbeit war, mit Hilfe zellspezifischer Mausmutanten und in vitro Methoden die Rolle myeloider Zellen im Mausmodell der Sauerstoff-induzierten Retinopathie zu untersuchen, um Konzepte für selektivere therapeutische Eingriffsmöglichkeiten aufzuzeigen.
METHODEN. Mäuse, die selektiv für VEGF-A in Zellen der myeloiden Zellreihe defizent sind, konnten durch Kreuzung von VEGFfl/fl- mit LysMCre-Mäusen auf einem genetischen C57BL/6J-Hintergrund erzeugt werden. Sowohl unbehandelte, als auch durch Clodronat-Liposomen makrophagendepletierte VEGF-A-defiziente LysMCre Mäuse wurden im Vergleich zu Geschwisterkontrolltieren im Modell der Sauerstoff-induzierten Retinopathie untersucht. Die Analyse der Netzhäute der Tiere erfolgte an den postnatalen Tagen 14 und 17 mittels quantitativer Real-Time PCR, immunhistochemischer Verfahren und Durchflusszytometrie. Parallel wurde in vitro die Menge des VEGF-A Transkripts in MIO-M1 Zellen, einer humanen Müller-Zelllinie, in alleiniger Kultur und in Ko-Kultur mit der murinen Mikrogliazelllinie BV-2 überprüft.
ERGEBNISSE. Übereinstimmend mit der Literatur zeigte sich an systemisch makrophagendepletierten Mäusen im Modell der Sauerstoff-induzierten Retinopathie eine Reduktion der avaskulären und neovaskulären Fläche, die jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Parallel fielen deutliche immunhistochemische VEGF-A Signale in Müllerzellen auf. Eine durchflusszytochemische Analyse von Netzhäuten neugeborener Mäuse bestätigte Makrophagen als die bei weitem größte Gruppe von Immunzellen. Die FACS-basierte Subspezifizierung von Makrophagen und Mikroglia zeigte, dass der Anteil residentieller Mikroglia nach Sauerstoffbehandlung signifikant anstieg. Jedoch hatte die zellspezifische VEGF-A-Defizienz in myeloiden Zellen keinen Einfluss auf die relative mRNA Expression von VEGF-A in der Gesamtretina. Weder die Netzhautmorphologie, noch die Größe der avaskulären Fläche als Ausdruck einer anti-angiogenen Wirkung war in den gendefizienten Mäusen verändert. Immunhistochemisch stellten sich die Müllerzellen nach Sauerstoffexposition morphologisch aktiviert dar. Eine Zellkulturstudie zeigte, dass die relative mRNA Expression von VEGF-A in MIO-M1 Müllerzellen signifikant höher war, wenn sie in Gegenwart von BV-2 Mikrogliazellen kultiviert wurden.
SCHLUSSFOLGERUNGEN. Unsere Ergebnisse aus dem Modell der Sauerstoff-indu-zierten Retinopathie legen nahe, dass nicht das aus myeloiden Zellen sezernierte VEGF-A pathologische retinale Neovaskularisation stimuliert. Aufgrund unserer in vitro erhobenen Befunde vermuten wir vielmehr einen indirekten Mechanismus. Wir postulieren, dass Makrophagen über die Freisetzung von Mediatoren die VEGF-A Sekretion aus Müllerzellen induzieren.
INTRODUCTION. Ischemic neovascular retinopathies (e.g. retinopathy of prematurity or diabetic retinopathy) still challenge the ophthalmic community as they represent the leading cause for blindness in industrialized countries. While the application of anti-VEGF-A-directed antibodies has revolutionized the treatment regime, some patients do not benefit due to a lack of response. Interestingly, depletion of macrophages reduces pathological neovascularization in the model of oxygen-induced retinopathy (an animal model for retinopathy of prematurity). Since, VEGF-A expression by macrophages has been considered to be the pathophysiologically relevant source of VEGF-A. The aim of this study was to analyze the relevance of myeloid cells in oxygen-induced retinopathy by using cell-specific mouse mutants and in vitro methods to reveal new therapeutical strategies.
METHODS. Mice that selectively lack VEGF-A-expression in myeloid cells were generated by crossbreeding VEGFfl/fl and LysMCre mice on a C57BL/6J background. Knockout mice with or without macrophage-depletion through systemic administration of clodronate-liposomes were analyzed in the model of oxygen-induced retinopathy. Their retinas were analyzed on postnatal days 14 and 17 by quantitative Real-Time PCR, immunohistochemistry, and flow cytometry. Furthermore, relative expression of VEGF-A was measured in an in vitro model in MIO-M1 cells, a human Müller cell line, cultured solitary and in co-culture with BV-2 cells, a murine microglia cell line.
RESULTS. In accordance with the literature, we found that macrophage-depleted mice in the mouse model of oxygen-induced retinopathy showed a reduced avascular and neovascular area which did not reach statistical significance in our studies. However, striking were the concomitantly prominent VEGF-A signals in immunohistochemical stainings of Müller cells. Flow cytometric analyses in retinas of newborn mice confirmed that macrophages represent by far the most dominant group of immune cells. FACS-based differentiation of macrophages and microglia showed that the relative number of residential microglia significantly increased after oxygen exposure. However, the myeloid-specific knockout of VEGF-A did not affect relative VEGF-A mRNA expression, retinal morphology or the size of the avascular area. Müller cells were morphologically activated in immunohistochemical stainings following oxygen-treatment. Relative VEGF-A mRNA expression in MIO-M1 cells was significantly higher in co-culture with BV-2 cells than alone.
CONCLUSIONS. Our data obtained from the model of oxygen-induced retinopathy suggest that myeloid cells do not stimulate retinal neovascularization through direct VEGF-A secretion. Instead, our in vitro data rather indicate that myeloid cells indirectly acitvate retinal VEGF-A via Müller cells. Thus we hypothesize that macrophages stimulate Müller cells to secrete VEGF-A through the release of soluble mediators.
