Cohen syndrome is a complex dysmorphic disorder caused by genetic defects in the COH1 gene. COH1 encodes the 450 kDa large peripheral membrane protein COH1 that is involved in the maintenance of the Golgi structure and intracellular transport processes. The majority of Cohen syndrome patients show loss-of-function variations in COH1. In addition, 13 COH1 non-synonymous single nucleotide variations (COH1-nsSNV) have been described for Cohen syndrome and autism. Their pathogenicity is yet to be elucidated. In general the necessity for a functional validation of nsSNV is gaining in importance due to the massive annotation of ge- nomic sequence variants uncovered by high-throughput genomic sequencing. This study aims at the functional in vivo and in silico characterization of the 13 COH1-nsSNV. In silico-analysis was performed using seven established pathogenicity prediction algorithms estimating eight COH1-nsSNV as pathogenic. For further in vitro experiments, 10 COH1- nsSNV were cloned into expression vectors using site-specific mutagenesis. To assess their subcellular localization COH1-wildtype and mutated COH1 (mutCOH1) were expressed in HeLa cells and subsequently detected by immunostaining. Six mutCOH1 did not localize to the Golgi apparatus. In line with this, the expression of these six mutCOH1 did not reconstitute the Golgi apparatus after COH1-RNAi-induced Golgi fragmentation. The COH1-nsSNV were classified as likely benign (p.Ala590Thr, p.Ser824Ala, p.Thr1289Ser, p.Asn2968Ser), likely pathogenic (p.Leu2168Arg, pTyr2316Cys, p.Gly2620Asp, p.Gly2704Asp, p.Gly2704Arg, p.Ser2748Leu) and with uncertain significance (p.Ile2795Thr, p.Ser3303Arg, p.Ala3691Thr) according to established standards and guidelines for the interpretation of sequence variants. This study shows that Cohen syndrome-associated COH1-nsSNV expose a variable pathogenic potential. Data further suggest a higher pathogenic potential in the central region of the protein (aa 2168-2748), notably in proximity to the putative SHR-binding-domain in COH1 (aa 2603- 2702). COH1-nsSNV in the C- and N-terminal regions appear to have a reduced pathological impact. Together with detailed family data, these findings may have further implications with respect to the study of COH1 and diagnosis of Cohen syndrome in the future. Further functional characterization of the identified pathogenic COH1-nsSNV will be crucial to decipher the func- tion of COH1 in Cohen syndrome and autism.
Das Cohen-Syndrom ist ein komplexes Dysmorphiesyndrom, das durch genetische Defekte im COH1-Gen verursacht wird. COH1 kodiert das 450 kDa große periphere Membranprotein COH1, das an dem Erhalt der Golgi-Struktur und an intrazellulären Transportprozessen beteiligt ist. Bei der Mehrzahl der Patienten verursachen loss-of-function-Varianten von COH1 im Sinne eines verfrühten Stoppcodons via nonsense-mediated mRNA decay das Cohen-Syndrom. Dagegen ist das pathogene Potential der 13 bislang beschriebenen nicht-synonymen COH1 Einzelnukleotidvarianten (COH1-nsSNV), die mit neuronalen Erkrankungen wie dem Cohen-Syndrom oder Autismus assoziiert wurden, unklar. Angesichts wachsender Genom-Datenmengen und damit auch der Anzahl von annotierten nsSNV ist die Beurteilung und Interpretation dieser Varianten essentiell, um einen individuellen Krankheitswert zu prüfen. In dieser Arbeit wurden die 13 COH1-nsSNV funktionell in vitro und in silico charakterisiert. Die in silico Analyse erfolgte mittels 7 etablierter Prädiktionsalgorithmen und ergab ein pathogenes Potential für 8 von 13 COH1-nsSNV. Für die in vitro Analyse wurden 10 COH1-nsSNV mittels ortsspezifischer Mutagenese in COH1-Expressionskonstrukte kloniert. Wildtyp-COH1 und die mutierten COH1 (mutCOH1) Proteine wurde hinsichtlich der intrazellulären Lokalisation an den Golgi-Apparat nach Überexpression in HeLa Zellen untersucht. Hier zeigte sich für 6 der mutCOH1 eine Dissoziation von der sonst kolokalisierenden Golgi-Struktur. Weiterhin wurde die Morphologie des Golgi-Apparates nach COH1-RNAi und anschließender Überexpression der COH1-nsSNV Konstrukte analysiert. In Einklang mit den Ergebnissen der Kolokalisation zeigte sich hier für die entsprechenden mutCOH1 keine Rekonstitution der durch COH1 knock-down induzierten Fragmentierung des Golgi-Apparates. Abschließend wurden die COH1-nsSNV nach etablierten Kriterien zur Charakterisierung von Sequenzvariationen evaluiert. Die mutCOH1 konnten als pathogen (p.Leu2168Arg, pTyr2316Cys, p.Gly2620Asp, p.Gly2704Asp, p.Ser2748Leu), benigne (p.Ala590Thr, p.Ser824Ala, p.Thr1289Ser, p.Asn2968Ser) und mit unklarem Effekt (p.Ile2795Thr, p.Ser3303Arg, p.Ala3691Thr) klassifiziert werden. Diese Arbeit zeigt, dass die mit dem Cohen-Syndrom-assoziierten COH1-nsSNV ein variables pathogenes Potential haben. Bezüglich der Struktur-Funktionsbeziehung zeigen die mutCOH1, die im mittleren COH1 Abschnitt (Aminosäuren 2168-2748) und in der Nähe der SHR-Bindungsdomäne (Aminosäuren 2603-2702) liegen, ein höheres pathogenes Potential. Diese Erkenntnis kann unter Einbeziehung weiterer Daten und des spezifischen Familienkontextes zukünftig Eingang in die genetische Diagnostik des COH1-Gens und des Cohen-Syndroms finden. Die weitere zellbiologische Charakterisierung der seltenen pathogenen mutCOH1, die nicht zu einem vollständigen loss-of-function des COH1-Proteins führen, wird bei der Identifizierung der molekularen Pathomechanismen von Cohen-Syndrom und Autismus eine wichtige Rolle spielen.
