Einleitung: Die nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist bereits die häufigste chronische Lebererkrankung in der westlichen Welt. Die komplexe Erkrankung wird als hepatische Manifestation des metabolischen Syndroms verstanden und ist eng mit der Insulinresistenz assoziiert. Genistein (GEN), ein natürlich vorkommendes Isoflavonoid, zeigte in zahlreichen Studien einen positiven Einfluss auf die NAFLD und der damit verbundenen Insulinresistenz. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung und Charakterisierung eines humanen in-vitro-Modells der Fettleber und die Evaluation der Effekte von GEN auf die hepatische Insulin-Signaltransduktion.
Material und Methoden: Primäre humane Hepatozyten (PHH) wurden aus chirurgisch reseziertem Lebergewebe isoliert. Anschließend erfolgte die Induktion einer Steatosis durch Inkubation mit 1 mM Öl- und Palmitinsäure (2:1) für 24 Stunden. Der Lipidgehalt wurde mittels Ölrot O-Färbung gemessen, die Zytotoxizität und die metabolische Aktivität mittels AST-, LDH- und Harnstoff-Assay sowie dem XTT-Assay bestimmt. Die Expression vom Insulinrezeptor (INSR) und Glukosetransporter Typ II (GLUT2) wurde durch realtime-PCR evaluiert. Veränderungen der Proteinphosphorylierungen von AKT, ERK1/2, FoxO1 und GSK3 α/β , in Abhängigkeit einer Inkubation mit und ohne 100 nM Insulin für 15 Minuten, wurden mittels Western Blot analysiert. In einer Konzentrationsreihe von 1 bis 100 µM wurden steatotische und nicht-steatotische PHH mit GEN für 24 Stunden behandelt.
Ergebnisse: Die mit freien Fettsäuren behandelten PHH zeigten einen signifikant erhöhten Lipidgehalt und eine moderate Lipotoxizität, wohingegen keine Einschränkung der metabolischen Kompetenz beobachtet werden konnte. In steatotischen PHH konnte eine reduzierte Insulin-induzierte Phosphorylierung von Akt, ERK1/2, GSK3 α/β und FoxO1 und ein moderater Anstieg der Expression von GLUT2 und INSR beobachtet werden. Die Behandlung mit GEN war in den Konzentrationen von 50 und 100 µM zytotoxisch. Steatotische PHH zeigten einen Anstieg der Phosphorylierung von ERK1/2 und GSK3 α/β sowie der GLUT2- und INSR-Expression mit ansteigender Konzentration von GEN. In nicht-steatotischen PHH konnte eine gesteigerte Akt-, ERK1/2- und GSK3 α/β -Phosphorylierung sowie eine erhöhte INSR-Expression mit ansteigender GEN-Konzentration nachgewiesen werden.
Diskussion: Das vorliegende humane in-vitro-Fettlebermodell ist eine verlässliche Reproduktion der in-vivo-Verhältnisse einer NAFLD bezüglich Lipidakkumulation, Lipotoxizität und Insulin-resistenz. Eine Behandlung mit GEN zeigte insulinotrope Effekte sowohl in steatotischen als auch in nicht-steatotischen PHH durch einen Dosis-abhängigen Anstieg der Phosphorylierung von Schlüsselproteinen der hepatischen Insulin-Signaltransduktion. Zudem zeigte sich eine erhöhte Expression von transmembranären Transportproteinen, was möglicherweise zu einer Verbesserung des hepatischen Energiestoffwechsels beitragen könnte.
Introduction: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is already the most common chronic liver disease in western countries. The complex disorder is regarded as the hepatic manifestation of metabolic syndrome and has been strongly associated with insulin resistance. Genistein (GEN), a natural soy isoflavone, has shown some potential benefits on NAFLD as well as insulin resistance in numerous epidemiological and experimental studies. Aim of the present study was the establishment and characterization of a human in-vitro fatty liver model and the evaluation of GEN effects on hepatic insulin signalling.
Materials and Methods: Primary human hepatocytes (PHH) were isolated from resected liver tissues. Steatosis was induced by adding 1 mM oleic and palmitic acid (2:1) for 24h. Lipid content was quantified by Oilred O staining and cytotoxicity and metabolic activity was evaluated by enzymatic assays of AST, LDH and urea as well as XTT cell viability assay. Alterations in mRNA expression of insulin receptor (INSR) and glucose transporter type 2 (GLUT2) were measured by realtime-PCR. Furthermore, changes in protein phosphorylation of AKT, ERK1/2, FoxO1 and GSK3α/β besides stimulation with and without 100 nM insulin for 15 minutes were analysed by Western Blot. Steatotic and non-steatotic PHH were stimulated with GEN at different concentrations ranging from 1 to 100 µM for 24h. Results: PHH treated with free fatty acids showed a significant increase in cytoplasmic lipid vesicles. A moderate lipotoxicity was observed whereas metabolic activity was not changed. We observed decreased insulin-induced phosphorylation levels of AKT, ERK1/2, GSK3α/β and FoxO1 in steatotic PHH. Furthermore, lipid-overloaded hepatocytes showed a slight elevation of GLUT2 and INSR expression levels. Additional treatment with GEN showed cytotoxicity at 50 and 100 µM. In steatotic PHH, we observed increased phosphorylation of ERK1/2 and GSK3α/β as well as increased expression of GLUT2 and INSR in a dose-dependent manner of GEN. In non-steatotic PHH, we observed an increased phosphorylation of Akt, ERK1/2 and GSK3α/β as well as an increased expression of INSR in a concentration-dependent manner of GEN, respectively.
Conclusion: Our data show that the human in-vitro model of NAFLD is a reliable reproduction of in-vivo conditions regarding fat accumulation, lipotoxicity and insulin resistance. Additional treatment with GEN showed insulinotropic effects in steatotic as well as non-steatotic PHH by an increased phosphorylation of insulin signalling related key proteins in a dose-dependent manner. Moreover, an increased expression of transmembrane transport proteins has been observed, suggesting an improvement of hepatic energy metabolism.
