Einleitung: hSNM1B/Apollo ist ein Protein der MBL/β-CASP-Familie, das in der DNA-Schadensantwort, insbesondere für die zelluläre Reaktion auf interstrand-crosslinks, bedeutsam ist. Apollo-depletierte Zellen weisen Hypersensitivitäten gegenüber alkylierenden Substanzen (z. B. Mitomycin C), aber auch ionisierender Strahlung auf. Daneben sind Funktionen Apollos in der Telomerprotektion bekannt. Ein einzelner Basenaustausch (C > T) im Apollo-Gen DCLRE1B wird durch in-silico-Prädiktionsprogramme als Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) eingestuft. Es besteht eine Assoziation des SNPs (rs11552449) mit erhöhtem Brustkrebsrisiko. Zur Untersuchung der Zusammenhänge des SNPs sowie des Apollo-Expressionslevels auf RNA-Ebene mit der Aktivierung einer DNA-Schadensantwort über ATM wurde in der vorliegenden Arbeit die Eignung des Western Blots mit anschließender Densitometrie überprüft. Zudem wurden Assoziationen des Polymorphismus mit der Telomerlänge untersucht. Methoden: Zur Untersuchung der Proteinkaskade erfolgten Anzucht und γ-Bestrahlung lymphoblastoider Zelllinien (LCLs, n = 12), die von gesunden Probanden aus der Berliner Altersstudie II stammen. Über den Nachweis im Western Blot wurde der Phosphorylierungsstatus für drei in die ATM-vermittelte Schadensantwort involvierte Proteine (ATM, p53, SMC1) bestimmt, mit einer Software (ImageQuant 5.2) densitometrisch ausgewertet und im Kontext von rs11552449-Genotyp (Sequenzierung) und Apollo-Expressionsniveau (qPCR) analysiert. In der qPCR ermittelte relative Telomerlängen aus LCLs (n= 62) sowie vorhandene Daten aus der BASE-II-Studie (n = 1710) wurden zudem auf den rs11552449-Genotyp bezogen hinsichtlich ihrer Unterschiede untersucht. Ergebnisse: Unterschiede zwischen den Phosphorylierungsgraden konnten für p53, ATM und SMC1 in Abhängigkeit von der Strahlendosis, nicht aber über den Kategorien des Genotyps (CC, CT, TT) oder für das Apollo-Expressionsniveau auf RNA-Ebene gezeigt werden. Genotyp-abhängige Unterschiede in der Telomerlänge (LCLs und Leukozyten) waren nicht nachweisbar. Schlussfolgerung: Die Ausgangshypothese, dass die Telomerlänge und der untersuchte SNP korrelieren, konnte nicht bestätigt werden. Für die Untersuchung der Zusammenhänge von IR-induzierter DNA-Schadensantwort und SNP sollten weitere Methoden auf ihre Eignung überprüft werden. Untersuchungen mit größeren Fallzahlen sowie die Betrachtung zusätzlicher Endpunkte sind zum tieferen Verständnis der Rollen und Interaktionen Apollos und des SNPs rs11552449 anzustreben.
Introduction: hSNM1B/Apollo is a protein of the MBL/β-CASP-family that functions in DNA-damage-response, especially regarding the cellular response to interstrand-cross-links. Apollo-depleted cells show hypersensitivity towards alkylating substances (e. g. mitomycin C), but also ionizing radiation (IR). In addition to its roles in DNA damage response, Apollo is known to have functions in the protection of telomeres, for instance via interaction with proteins of the shelterin-complex such as TRF2. A single base exchange (C > T) in the Apollo gene, DCLRE1B has been identified as a single nucleotide polymorphism (SNP) by in-silico-prediction programs. An association of this SNP with an elevated risk of breast cancer has been shown. In this study, the suitability of Western Blot as a method for the investigation of the relationship between rs11552449 as well as the Apollo RNA-expression with the activation of the DNA-damage-response pathway via ATM have been tested. Moreover, this relationship as well as the correlation of the polymorphism with telomere length have been studied. Methods: Investigation of the ATM pathway was performed through cultivation of lymphoblastoid cell lines (LCLs, n = 12) established from healthy subjects from the Berlin Aging Study II (BASE-II) and exposure to ionizing radiation. Western blotting and densitometry via the ImageQuant software were used to determine the changes in phosphorylation after exposure. The results were analyzed with respect to the genotype of the investigated SNP that had been determined via qPCR beforehand as well as the Apollo RNA-expression known from qPCR experiments. This was performed for three proteins involved in the ATM-pathway (ATM, p53, SMC1). Relative telomere length was identified through qPCR for LCLs (n = 62). The association of the obtained data as well as data from the Berlin Aging Study II (n = 1710) with the rs11552449 genotype was then tested. Results: Significant differences were detected between the phosphorylation status of p53, ATM and SMC1 according to the different radiation dose, however, not regarding the categories of the SNP‘s genotype as well as the Apollo RNA expression level. As for telomere length, neither in LCLs nor in leukocytes significant differences were found in relation to the rs11552449 genotype. Conclusion: The initial hypothesis that telomere length and SNP would correlate could not be confirmed. In order to investigate the associations of IR-induced DDR and the SNP further, other methods should be tested regarding their suitability. Also, future investigations with larger sample groups and additional endpoints will be needed for a deeper understanding of the roles and interactions of Apollo in the context of rs11552449 genotype.
