Ribosomal protein biosynthesis (translation) is a crucial process in all domains of life. This work aims to investigate the process of translation in the mammalian system by means of single particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM). The focus of this thesis lies on the following two aspects of mammalian translation: 1) Translocation by the mammalian cytosolic 80S ribosome. Translocation moves the tRNA2•mRNA module directionally through the ribosome during the elongation phase of translation and is associated with large scale conformational changes within both the ribosome and the bound tRNAs. It is catalyzed by the GTPase eEF2 (EF-G in bacteria). Although knowledge on translocation, especially in the bacterial system, has accumulated in the past years, the detailed mechanisms are not fully understood. In particular, the role of GTP hydrolysis is controversial and structural knowledge on translocation in the mammalian system has been missing. In this work, three high-resolution structures of in vitro reconstituted authentic intermediates of translocation by the mammalian 80S ribosome are presented. They are trapped by the non-hydrolysable GTP analog GMPPNP and contain, in contrast to similar experiments in the bacterial system, the translocase eEF2 and a complete tRNA2•mRNA module. Single-molecule imaging, carried out in collaboration with Prof. Scott Blanchard and colleagues, revealed that GTP hydrolysis principally facilitates rate-limiting, late steps of translocation, consistent with the presented cryo-EM structures. Comparison with the bacterial system showed that distinctions between bacterial and mammalian translocation mechanisms originate from differential dissociation rates of deacylated tRNA from the E site. Further, a cryo-EM structure of a mammalian 80S ribosome containing a complete tRNA2•mRNA module and eEF2•GDP is presented, which stems from a sample prepared by in vitro translocating a PRE complex using eEF2•GTP. In contrast to the GMPPNP-stalled translocation intermediates, this structure gives insight into the interaction of unstalled eEF2 with the 80S ribosome. 2) The influence of serum on the energy landscape of mammalian translation and on the structure of ribosomal protein eS6. Serum treatment of cells intervenes with many signaling pathways, but it is not known if the energy landscape of translation is altered upon its influence. Serum deprivation and restimulation can be used as a model system to diminish and enhance phosphorylation of ribosomal protein eS6, which is a eukaryote-specific protein on the small ribosomal subunit. The phosphorylation of the C-terminus of eS6 has been investigated since a long time, however, its mechanistic role has not been elucidated yet. In particular, hardly anything is known on possible structural impacts of eS6 phosphorylation. The presented work reveals that serum deprivation and restimulation do not have an impact on the energy landscape of translation for the ex vivo derived cytosolic fraction of polysomes. However, the observation of different yields of cell lysate from serum deprived and restimulated cells led to the proposition of a new hypothesis that suggests cellular redistribution of ribosomes. The phosphorylation of ribosomal protein eS6, which strongly correlates with serum treatment, does not lead to observable structural changes in the small ribosomal subunit. Finally, the structural analysis and in silico sorting of the obtained translation intermediates led to the identification of two previously not observed substates of the 80S rotated PRE ribosome and to the unprecedented visualization of two distinct, native inititation complexes.
Die ribosomale Proteinbiosynthese (Translation) ist ein zentraler Prozess in allen Lebensdomänen. In der vorliegenden Arbeit wird der Mechanismus der mammalischen Translation mithilfe der kryogenen Elektronenmikroskopie (cryo-EM) untersucht. Der Fokus liegt hierbei auf den folgenden zwei Aspekten der mammalischen Translation: 1) Die Translokation durch das mammalische, zytosolische 80S Ribosom. Die Translokation ist die gerichtete Bewegung des tRNA2•mRNA Moduls durch das Ribosom während der Elongationsphase der Proteinbiosynthese und ist mit umfangreichen Konformationsänderungen des Ribosoms und der gebundenen tRNAs assoziiert. Sie wird durch die GTPase eEF2 (EF-G in Bakterien) katalysiert. Obwohl während der vergangenen Jahre viel über die Translokation, vor allem im bakteriellen System, zusammengetragen wurde, bleibt der genaue Mechanismus unverstanden. Insbesondere die Rolle der GTP-Hydrolyse ist kontrovers und es fehlen strukturelle Daten über die Translokation im mammalischen System. In dieser Arbeit werden drei hochaufgelöste Strukturen in vitro rekonstituierter, authentischer Translokationsintermediate des mammalischen 80S Ribosoms präsentiert. Sie konnten mithilfe des nicht-hydrolysierbaren GTP-Analogons GMPPNP eingefangen werden und enthalten im Gegensatz zu ähnlichen Experimenten im bakteriellen System die Translokase eEF2 und ein komplettes tRNA2•mRNA Modul. Die in Kollaboration mit Herrn Prof. Scott Blanchard und seinen Kollegen durchgeführte Einzelmolekül-Bildgebung ergab, dass die GTP-Hydrolyse hauptsächlich späte, geschwindigkeitslimitierende Schritte der Translokation fördert, eine Beobachtung, die in Einklang mit den präsentierten cryo-EM Strukturen steht. Der Vergleich mit dem bakteriellen System schließlich zeigt, dass Unterschiede zwischen bakteriellen und mammalischen Translokationsmechanismen in verschiedenen Dissoziationsraten der deacylierten tRNA von der E Stelle begründet sind.
Desweiteren wird die cryo-EM Struktur eines mammalischen 80S Ribosoms mit einem kompletten tRNA2•mRNA Modul und eEF2•GDP präsentiert, welche aus einer Probe stammt, für deren Herstellung ribosomale Prä-Komplexe in vitro mit eEF2•GTP transloziert wurden. Anders als die mit eEF2•GMPPNP eingefangenen Translokationsintermediate gewährt diese Struktur Einblick in die Interaktion von unmanipuliertem eEF2 mit dem 80S Ribosom. 2) Der Einfluss von Serum auf die Energielanschaft der mammalischen Translation und auf die Struktur des ribosomalen Proteins eS6. Die Behandlung von Zellen mit Serum greift in viele Signalwege ein, doch es ist nicht bekannt, ob auch die Energielandschaft der Translation beeinflusst wird. Serum-Deprivation und -Stimulation kann als Modellsystem für die Verringerung und Steigerung der Phosphorylierung des ribosomalen Proteins eS6, einem Eukaryoten-spezifischen Protein der kleinen ribosomalen Untereinheit, angewendet werden. Die Phosphorylierung des C-Terminus von eS6 wird seit langer Zeit erforscht, jedoch ist ihre mechanistische Bedeutung bisher unbekannt. Vor allem weiß man kaum etwas über mögliche strukturelle Auswirkungen der eS6-Phosphorylierung. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Serum-Deprivation und -Stimulation keinen Einfluss auf die Energielandschaft der Translation in der zytosolischen Fraktion der ex vivo gewonnenen Polysomen hat. Die Beobachtung eines Unterschieds in den Zelllysatausbeuten zwischen Serum-deprivierten und -stimulierten Zellen führte jedoch zu einer neuen Hypothese, welche die zelluläre Umverteilung von Ribosomen nahelegt. Die Phosphorylierung des ribosomalen Proteins eS6, welche stark mit der Serumbehandlung korreliert, führte zu keinen sichtbaren strukturellen Veränderungen in der kleinen ribosomalen Untereinheit. Zu guter Letzt führte die Strukturanalyse und in silico Sortierung der erhaltenen Translationsintermediate zu der Identifikation zweier bisher nicht beobachteten Unterzustände des 80S rotierten Prä-Ribosoms sowie zu der erstmaligen Visualizierung zweier verschiedener, nativer Initiationskomplexe.
