Cellular senescence was discovered in cell culture by Hayflick and Moorhead in 1965 in human fibroblasts. It is primarily characterized by irreversible cell cycle arrest and an altered, enlarged morphology. Senescent cells are thought to accumulate with age in a variety of species including mice, monkey and man. Also, they are thought to drive tumor growth and progression via their senescence-associated secretory phenotype. No known biomarker for cellular senescence is completely specific. Senescence is often triggered by DNA damage, following classical tumor suppressor pathways and activation of cyclin-dependent kinase inhibitors. Looking towards current literature, two potential biomarkers for cellular senescence, DNA-damage marker γH2AX, and cyclin-dependent kinase inhibitor p21, were selected to be tested for transferability on formalin-fixed and paraffin-embedded canine tissue. Most studies on cellular senescence have been conducted in cell culture and to our knowledge none on canine tissues. Human gene products of the DNA damage response are more closely related to dog than to rodent which might make them a superior model. The aim of this study was to test the hypotheses that senescence markers γH2AX and p21 increase with age and in the microenvironment of tumors. Two organ systems that are known to show age-dependent pathologies, testis and eye, were studies for age-dependent increase of senescent cells. For the testis, senescence markers expression was also correlated with age-dependent morphological changes (Leydig cells / intertubular triangle, modified Johnsen score for evaluation of spermatogenesis, interstitial collagen content, epithelial area / tubular area, tubular diameter). Additionally, the microenvironment of testicular (Leydig cell tumor, seminoma, Sertoli cell tumor) and ocular (uveal melanocytoma, ciliary body adenoma) tumors were examined for possible increase of senescent cells. As both used markers are also expressed in tumors, their role as tumor markers in ocular melanocytic tumors (benign uveal melanocytoma, malignant conjunctival melanoma) and testicular tumors was also studied. In the canine testis an age-dependent significant increase could only be noted for p21 in fibroblasts and Leydig cells. However, the expression remained a rare event with only small amounts of cells. Morphological age-dependent changes were only seen in a significant increase of Leydig cells / intertubular triangle and a decrease in spermatogenesis (modified Johnsen score). However, contrary to my expectations, tubular diameters and epithelial areas / tubular areas did not decrease and interstitial collagen content did not increase with age. In the microenvironment of testicular tumors, p21 and γH2AX expression was rare. In testicular tumor cells, γH2AX expression was most prominent in Sertoli cell tumors, followed by seminomas and Leydig cell tumors, whereas p21 expression was most prominent in Leydig cell tumors and low in Sertoli cell tumors and seminomas. These findings correlated with their ki67 indices, where Sertoli cell tumors and seminomas were mitotically more active than Leydig cell tumors. In the canine eye, no age-dependent increase of senescence marker expression could be noted in any examined ocular compartment. In eyes with ocular tumors significantly more p21 and γH2AX expression could be noted in comparison to young eyes particularly in the retina, uvea and lens. However, a tumor-induced pressure increase is likely to have resulted in the higher expression due to cell damage. Tumor cells of benign uveal melanocytomas contained more p21 positive cells than malignant conjunctival melanomas. γH2AX and p21 could not show a convincing age-dependent increase in the canine testis and eye. Morphological changes, the tendency of tumor development and increase in age-related pathologies make it unlikely that the canine testis and eye do not age. Either these tissues do not show an accumulation of senescent cells or a different yet to be found biomarker is needed. A possible bidirectional cross-talk of tumor microenvironment and tumor cells could only be identified for ocular tumors, but this was most likely tumor-induced and not primary age-dependent senescence. P21 as tumor marker for malignancy in melanocytic tumors may be considered.
Zelluläre Seneszenz wurde erstmals 1965 von Hayflick und Moorhead in humanen Fibroblasten in Zellkultur beschrieben. Zelluläre Seneszenz ist primär charakterisiert durch einen irreversiblen Zellzyklusarrest und eine veränderte, vergrößerte Morphologie. Seneszente Zellen akkumulieren im Alter in einer Vielzahl von Spezies unter anderem Maus, Affe und Mensch. Durch die Ausprägung eines sogenannten Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps werden sie zudem mit der Förderung von Tumorwachstum und -progression in Verbindung gebracht. Bis heute gilt kein bekannter Seneszenzmarker als spezifisch. Seneszenz wird meist über DNA-Schäden ausgelöst mit nachfolgender Aktivierung der Tumor-Suppressor Signalwege und deren Inhibitoren cyclin-abhängiger Kinasen (CDK). Mit Blick auf aktuelle Literatur wurden γH2AX, Marker für DNA-Schäden, und p21, CDK (cyclin-dependent kinase)-Inhibitor 1 als potentielle Biomarker der Seneszenz ausgewählt, um eine Übertragbarkeit von Zellkulturversuchen auf Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettetes kanines Gewebe zu testen. Die meisten Studien zur Seneszenz wurden bislang in Zellkultur betrieben und soweit wir wissen keine an kaninem Gewebe. Humane Genprodukte der DNA-Schäden-Reaktion sind näher verwandt mit dem Hund als mit dem Nager, weshalb der Hund möglicherweise ein besseres Model darstellt. Zweck dieser Studie war es die Hypothese zu testen, dass Seneszenzmarker γH2AX und p21 im Alter und in der Umgebung von Tumoren zunehmen. Hierfür wurden zwei Organsysteme, Hoden und Augen, ausgewählt, bei denen bekannt ist, dass sie altersabhängige Pathologien zeigen. Beim Hoden wurde die Expression der Seneszenzmarker auch mit altersabhängigen morphologischen Veränderungen (Leydig Zellen / intertubulärem Dreieck, modifizierter Johnsen Score zur Evaluierung der Spermatogenese, interstitieller Kollagengehalt, Epithelfläche / Tubulusfläche, tubulärer Diameter) korreliert. Zusätzlich wurde eine Zunahme seneszenter Zellen in der Tumorumgebung von testikulären (Leydigzelltumor, Seminom, Sertolizelltumor) und okularen Tumoren (uveale Melanozytome, Ziliarkörperadenome) überprüft. Da beide Marker auch in Tumorzellen exprimiert werden, wurde auch ihre Rolle als Tumormarker in okularen Tumoren (benigne uveale Melanozytome, maligne konjunktivale Melanome) und in testikulären Tumoren untersucht. Im kaninen Hoden zeigte sich eine signifikante altersabhängige Zunahme p21 positiver Fibroblasten und Leydigzellen. Allerdings handelte es sich hierbei um wenige Einzelzellen. Die einzigen signifikanten altersabhängigen morphologischen Unterschiede zeigten sich in einer Zunahme von Leydigzellen / intertubulärem Dreieck und einer Abnahme der Spermatogenese (modifizierter Johnsen Score). Entgegen der Erwartungen nahmen der tubuläre Diameter und die Epithelfläche / Tubulusfläche nicht ab und der interstitielle Kollagengehalt nicht zu. In der Umgebung von testikulären Tumoren zeigte sich nur eine sehr geringe Expression von γH2AX und p21. In testikulären Tumorzellen wiesen Sertolizelltumoren die stärkste Expression von γH2AX in auf, gefolgt von Seminomen und Leydigzelltumoren. Hingegen zeigte sich die stärkste Expression von p21 in Leydigzelltumoren und war sehr niedrig in Sertolizelltumoren und Seminomen. Diese Ergebnisse korrelierten mit denen der ki67-Indexe, bei denen sich Sertolizelltumoren und Seminome als mitotisch deutlich aktiver zeigten als Leydigzelltumoren. In kaninen Augen zeigte sich in keinem der untersuchten Kompartimente des Auges eine altersabhängige Zunahme der Seneszenzmarker. In Augen mit okularen Tumoren zeigte sich im Vergleich zu jungen Augen eine signifikante Zunahme der p21 und γH2AX Expression besonders in der Retina, der Uvea und der Linse. Allerdings ist eine durch den Tumor ausgelöste Druckerhöhung im Auge wahrscheinlich verantwortlich für eine erhöhte Expression der Marker durch vermehrte Zellschäden. Tumorzellen benigner uvealer Melanozytome zeigten eine deutlich höhere Expression p21 positiver Zellen als maligne konjunktivale Melanome. Eine überzeugende altersabhängige Zunahme von γH2AX und p21 konnte in kaninen Hoden und Augen nicht nachgewiesen werden. Morphologische Veränderung, die Neigung zur Tumorentstehung und eine Zunahme altersabhängiger Pathologien machen es unwahrscheinlich, dass kanine Hoden und Augen nicht altern. Entweder zeigen diese Gewebe keine altersabhängige Akkumulation seneszenter Zellen oder ein anderer noch zu findender Biomarker ist hierfür nötig. Eine mögliche bidirektionale Beeinflussung von Tumorumgebung und Tumorzellen konnte nur in okularen Tumoren gesehen werden, jedoch ist hier eine durch den Tumor ausgelöste Druckerhöhung mit folgendem Zellschaden wahrscheinlicher als eine primär altersabhänge Seneszenz. P21 könnte als möglicher Tumormarker für Malignität in melanozytären Tumoren in Betracht gezogen werden.
