Epidermal Dendritic cells, termed Langerhans cells (LC), together with dermal Dendritic cells (DDC), represent the most outer immunological sentinels of the human skin. Acting as specific cutaneous antigen-presenting cells, skin resident DC subtypes perform key roles in mediating the adaptive T cell-triggered immune response. Gained present insights of their functional specializations are largely derived from mouse models. Our understanding of human skin DC is comparatively limited, relying on the use of excised skin and ex vivo differentiated DC derived from peripheral blood monocytes. Hence, this thesis aimed to evaluate monocyte-derived Langerhans-like cells (MoLC) and monocyte-derived dendritic cells MoDC as in vitro test systems to study the complex immune regulatory functions of epidermal LC and DDC. Specific focus was placed on pathologically inflamed skin as found in conditions such as psoriasis and allergic contact dermatitis (ACD). In accordance to the distinct Toll-like receptor (TLR) expression patterns of their in vivo counterparts, MoDC stimulated with bacterial pathogen-associated molecular patterns (PAMP) increased the expression of surface maturation markers CD83/CD86, enhanced the secretion of pro-inflammatory cytokines driving Th1 and Th17 responses. CCR7 was also upregulated, in turn promoting increased MoDC migratory capacity towards CCL21 gradients. Conversely, MoLC displayed relatively little response following exposure to microbial antigens. This immunological inactivity underlines the tolerogenic function of human LC towards bacteria which is important to consider with regard to the maintenance of skin-associated commensals. Invading microbes that infiltrate down to the dermis, on the other hand will instigate a DDC- triggered immune response. Activation of MoLC by a synthetic analog of viral PAMP strongly provoked maturation and Th1-related IL-12p70 release. This same treatment left the MoDC relatively unaffected. This data is in line with existing literature demonstrating that human LC render direct anti-viral activity as they are ideally located at the most outer part of the skin. Interestingly, the results revealed distinct differences in the reactivity of MoLC and MoDC towards bacterial and viral PAMP under sterile-inflammatory conditions induced by TNF and IL-1β. TNF and IL-1b are primarily secreted by skin-resident cells due to inflammatory stimuli, thereby affecting surrounding DC. MoLC activated by TNF and IL-1β increased Th1 and Th17 cytokine Summary Summary secretion and induced the development of IFN-g-producing Th1 cells when co- stimulated with TLR agonists whereas MoDC amplified cytokine release, but without modulating the cytokine pattern. When applied in addition to TNF and IL-1b, a synthetic TLR3 ligand mimicking viral infection led to an increased release of Th1 and Th17 cytokines from MoLC and induced IL-6 secretion in MoDC. The findings imply an immune regulatory function for TNF- and IL-1b-mediated inflammatory environment, where susceptibility towards pathogens and modulation of immune regulatory properties of MoLC and MoDC are rendered. Hence, the complex cross- talk between specific DC subsets is shaped by the local inflammatory setting established by skin-resident cells, which is important to consider with regard to emergence chronic inflammatory skin disorders. Very recent findings have highlighted ontogenetic, phenotypic, and functional similarities between monocyte derived LC or DC and inflammatory DC subsets detected in lesional skin in autoimmune skin diseases. Accordingly, ex vivo generated epidermal LC and DDC might resemble inflammatory DC subsets and could be utilized for the investigation of pathological inflammatory skin conditions. Several drugs, including the anti-malarial chloroquine and the beta-adrenoceptor antagonist (beta-blocker) propranolol, are known to induce and/or exacerbate psoriasis-like skin inflammation. However, the specific pathomechanism remains unknown. Interestingly, chloroquine and propranolol share common physico-chemical properties that lead to their accumulation within lysosomes, a property termed lysosomotropism. Since a key determinant in the pathogenesis of psoriasis revolves around the IL-23/Th17 axis, MoLC and MoDC were used to investigate the lysosomotropism-induced modulation of inflammatory responses in dendritic cells. Chloroquine and propranolol raised the pH within native acidic cell compartments, confirming a lysosomotropic character. Interestingly, lysosomotropism strongly induced IL-23 release in IL-1b-activated MoLC and subsequently elevated the release of IL-17A by CD4+ T cells. IL-1R-mediated NF-kB signaling and p38 MAPK activation were necessary for lysosomotropism-triggered IL-23 secretion. Furthermore, p38 enhanced the binding of the NF-kB transcription factor RelB to IL23A promoter regions. Autophagy has been associated with the secretion of IL-1 family cytokines that are upregulated in chronic inflammatory disorders such as psoriasis. Both, chloroquine and propranolol elevated the expression levels of p62 and the conversion of LC3-I to LC3-II, both markers of active autophagy. Moreover, 143 144 propranolol specifically increased expression of PINK1, a protein that plays a key role in mitophagy, and mitochondrial DNA levels, indicating a late stage block in autophagy. Concomitantly, propranolol provoked mitochondria-derived ROS formation. Notably, scavenging of ROS fully abolished IL-23 secretion. The data highlight an interference with autolysosomal maturation triggered by lysosomotropic compounds, as underscored by the increased abundance of autophagy-related substrates and ROS-producing mitochondria. These results provide insight into a potentially pivotal immune regulatory mechanism stimulating IL-23 release from cutaneous dendritic cells, thereby contributing to Th17-mediated psoriasis-like skin inflammation. The induction of ACD by xenobiotics and haptens follows several essential steps such as percutaneous penetration, subsequent haptenization, and the provocation of epidermal/dermal inflammation and cutaneous DC activation. To emulate ACD and investigate crucial molecular events driving early responses to skin sensitization and the disease’s initially pathogenesis study this, reconstructed human skin (RHS) with integrated epidermal DC was developed. This consisted of a dermal compartment composed of human fibroblasts and collagen, layered underneath an epidermal compartment consisting of human keratinocytes and Langerhans-like cells; MoLC or MUTZ-LC. Firstly, the RHS was demonstrated to sufficiently resemble human skin in its stratification and LC allocation, LC quantity and LC maturation of prominent dendrites. Next, MoLC-RHS and MUTZ-LC-RHS were topically treated with the extreme skin sensitizer 2, 4-dinitrochlorobenzene (DNCB), which provoked an enhanced release of IL-6 and CXCL8/IL-8. It also increased transcriptional activity of LC activation markers CD83, PDL1, and CXCR4 in the dermis, as well as induced an elevated mobility of LC-like cells towards the dermal compartment. Summarily, RHS incorporating MoLC or MUTZ-LC display the fundamental early immune events seen in vivo induced by extreme skin sensitizers. As such, they allow for the investigation of immunological response by LC in the pathogenesis of ACD. This advanced research tool may help to unravel how skin-resident keratinocytes, fibroblasts and LC co-operatively initiate ACD, as well as contributing to the search for valid predictive read-out markers in hazard assessment of potential skin sensitizers.
Epidermale dendritische Zellen, genannt Langerhans-Zellen (LC), stellen zusammen mit dermalen dendritischen Zellen (DDC) die ersten immunologischen Wächter der menschlichen Haut dar. Als spezifische kutane Antigen-präsentierende Zellen, übernehmen Haut-besiedelnde DC-Subtypen Schlüsselfunktionen bei der erworbenen T-Zell-vermittelten Immunantwort. Die derzeitigen gewonnenen Erkenntnisse ihrer funktionalen Spezialisierungen stammen größtenteils aus Mausmodellen. Unser Verständnis von menschlichen Haut-DC ist vergleichsweise begrenzt und basiert auf der Verwendung von exzidierter Haut und ex vivo differenzierten DC, die von humanen peripheren Blutmonozyten stammen. Die vorliegende Arbeit befasst sich daher mit der Untersuchung von Monozyten- abgeleiteten Langerhans-ähnlichen Zellen (MoLC) und von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDC) sowie von MoDC als in vitro Testsystemen zur Untersuchung der komplexen immunregulatorischen Funktionen epidermaler LC und DDC. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf pathologisch entzündeter Haut, wie sie bei Psoriasis und allergischer Kontaktdermatitis auftritt. In Übereinstimmung mit den unterschiedlichen Toll-like Rezeptor (TLR)- Expressionsmustern ihrer in vivo Pendants, steigerten MoDC die Expression der Oberflächenreifungsmarker CD83/CD86 und verstärkten die Sekretion von Th1- und Th17-Antwort einleitenden pro-inflammatorischen Zytokinen nach Stimulation mit bakteriellen Antigenen. CCR7 wurde ebenfalls hochreguliert, wodurch eine erhöhte MoDC-Migrationskapazität in Richtung eines CCL21-Gradienten gefördert wurde. MoLC zeigten hingegen eine relativ schwache Reaktion nach Exposition gegenüber mikrobiellen Antigenen. Diese immunologische Inaktivität unterstreicht die tolerogene Funktion der humanen LC gegenüber Bakterien, was im Hinblick auf die Aufrechterhaltung der kommensalen Hautflora entscheidend ist. Andererseits lösen die in die Dermis eindringenden Mikroben eine DDC-initiierte Immunantwort aus. Die Aktivierung von MoLC durch virale TLR-Agonisten provozierte eine starke Reifung und eine Th1-Antwort-fördernde IL-12p70 Freisetzung. MoDC zeigen bei gleichen Konditionen ein nur geringes Ansprechen. Dies stimmt mit aktueller Literatur überein, die demonstrieren konnte, dass humane LC eine direkte anti-virale Aktivität besitzen, was sie für ihre ideale Lage in der äußersten Schicht der Haut prädestiniert. 145 146 Interessanterweise zeigten die Ergebnisse deutliche Unterschiede in der Reaktivität von MoLC und MoDC gegenüber bakteriellen und viralen pathogenen Strukturen unter sterilen entzündlichen Bedingungen, induziert durch TNF und IL-1b. TNF und IL-1b werden hauptsächlich durch Zellen der Haut aufgrund von Entzündungsstimuli sezerniert, wodurch umliegende DC beeinflusst werden. Durch TNF und IL-1β aktivierte MoLC steigerten die Sekretion von Th1- und Th17-Zytokinen und induzierten die Entwicklung von IFN-g-produzierenden Th1-Zellen bei Co-Stimulation mit TLR-Agonisten, wohingegen MoDC die Zytokinfreisetzung verstärkten ohne jedoch das Zytokinmuster zu modulieren. Zusätzlich zu TNF und IL-1b führten pathogene virale Strukturen zu einer erhöhten Freisetzung von Th1- und Th17- Zytokinen aus MoLC und induzierten die IL-6-Sekretion von MoDC. Diese Ergebnisse implizieren eine immunregulatorische Funktion für lokale TNF und IL-1β- vermittelte Entzündungen, in denen eine gesteigerte Anfälligkeit für TLR- adressierende Pathogene und eine Modulation der immunregulatorischen Eigenschaften von MoLC und MoDC provoziert wird. Die komplexe Immunantwort spezifischer DC-Subgruppen wird durch das lokale Entzündungsmilieu in der Haut entscheidend beeinflusst. Dies spielt ferner eine zentrale Rolle bei der klinischen Manifestation chronisch entzündlicher Hauterkrankungen. Jüngste Untersuchungsergebnisse konnten ontogenetische, phänotypische und funktionelle Ähnlichkeiten zwischen Monozyten-abgeleiteten LC oder DC und inflammatorischen DC-Subgruppen, gewonnen aus läsionalen Plaques bei immun-vermittelten Hautentzündungen, feststellen. Dementsprechend könnten ex vivo erzeugte epidermale LC und DDC entzündlichen DC-Subtypen ähneln und könnten für die Untersuchung von pathologischen entzündlichen Hauterkrankungen von großem Nutzen sein. Es ist bekannt, dass verschiedene Arzneistoffe, einschließlich des Anti-Malaria- Wirkstoffes Chloroquin und des Beta-Adrenozeptor-Antagonisten (Beta-Blocker) Propranolol, Psoriasis-ähnliche Hautentzündungen induzieren und/oder verstärken. Der spezifische Pathomechanismus bleibt jedoch unbekannt. Interessanterweise haben Chloroquin und Propranolol gemeinsame physikalisch-chemische Eigenschaften, die zu ihrer Akkumulation innerhalb von Lysosomen führen, was als Lysosomotropismus bezeichnet wird. Da eine Schlüsseldeterminante in der Pathogenese der Psoriasis um die IL-23/Th17-Achse kreist, wurden MoLC und MoDC verwendet, um die durch Lysosomotropismus induzierte Modulation von Summary
Summary Entzündungsreaktionen in dendritischen Zellen zu untersuchen. Chloroquin und Propranolol erhöhten den pH-Wert innerhalb nativer saurer Zellkompartimente, was einen lysosomotropen Charakter bestätigte. Interessanterweise induzierte Lysosomotropismus eine deutliche IL-23-Freisetzung in IL-1β-aktivierten MoLC und erhöhte anschließend die Freisetzung von IL-17A durch CD4+ T-Zellen. Die IL-1R- vermittelte NF-κB-Signaltransduktion und p38-MAPK-Aktivierung waren zwingend erforderlich für die durch Lysosomotropismus ausgelöste IL-23-Sekretion. Darüber hinaus verstärkte p38 die Bindung des NF-κB-Transkriptionsfaktors RelB an IL23A- Promotorregionen. Autophagie ist mit der Sekretion von Zytokinen der IL-1-Familie assoziiert, die bei chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Psoriasis hochreguliert sind. Sowohl Chloroquin als auch Propranolol erhöhten die Expressionsspiegel von p62 und die Umwandlung von LC3-I zu LC3-II, beides Marker aktiver Autophagie. Außerdem erhöhte Propranolol spezifisch die Expression von PINK1, einem Protein, das eine Schlüsselrolle in der Mitophagie spielt sowie von mitochondrialer DNA, was auf einen späten Block in der Autophagie Maschinerie hinweist. Gleichzeitig provozierte Propranolol mitochondriale ROS-Bildung. Bemerkenswerterweise hob das Neutralisieren von ROS die IL-23-Sekretion vollständig auf. Unsere Daten weisen auf eine Störung der autolysosomalen Reifung durch lysosomotrope Verbindungen hin, was durch die vertsärkte Ansammlung von autophagosomalen Substraten und ROS-produzierenden Mitochondrien unterstrichen wird. Diese Ergebnisse liefern Einblicke in einen möglicherweise entscheidenden immunregulatorischen Mechanismus, der die Freisetzung von IL-23 aus kutanen dendritischen Zellen stimuliert und dadurch zur Th17-vermittelten Psoriasis-ähnlichen Hautentzündung beiträgt. Die Induktion von allergischer Kontaktdermatitis (ACD) durch Xenobiotika und Haptene umfasst mehrere essentielle Schritte wie perkutane Penetration, anschließende Haptenisierung und die Provokation von epidermaler/dermaler Entzündung und Aktivierung kutaner DC. Um ACD nachzubilden und wichtige molekulare Ereignisse zu untersuchen, die die frühen Reaktionen der Hautallergisierung und die initiale Pathogenese der Erkrankung steuern, haben wir rekonstruierte humane Haut (RHS)-Äquivalente mit integrierten epidermalen DC entwickelt. Diese bestanden aus einem dermalen Kompartiment, das sich aus humanen Fibroblasten und Kollagen zusammensetzte und unter einem epidermalen Kompartiment lag, das wiederum aus humanen Keratinozyten und Langerhans- 147 148 ähnlichen Zellen gebildet wurde; MoLC oder MUTZ-LC. Zuerst wurde demonstriert, dass das RHS in seiner Stratifikations- und LC-Verteilung, LC-Menge und LC- Reifung von herausragenden Dendriten ausreichend der menschlichen Haut ähnelt. Im Anschluss wurden MoLC-RHS und MUTZ-LC-RHS topisch mit dem extremen Hautsensibilisator 2, 4-Dinitrochlorbenzol (DNCB) behandelt, was eine verstärkte Freisetzung von IL-6 und CXCL8/IL-8 bewirkte. Es erhöhte ebenso die Transkriptionsaktivität der LC-Aktivierungsmarker CD83, PDL1 und CXCR4 in der Dermis und induzierte eine erhöhte Mobilität von LC-ähnlichen Zellen in Richtung dermales Kompartiment. Zusammenfassend zeigen RHS mit MoLC oder MUTZ-LC die fundamentalen frühen Immun-Ereignisse in vivo, die durch extreme Hautsensibilisatoren hervorgerufen werden. Als solche erlauben sie die Untersuchung der immunologischen Antwort von LC in der Pathogenese von ACD. Dieses weiterentwickelte Forschungsinstrument könnte helfen, herauszufinden wie Keratinozyten, Fibroblasten und LC in Kooperation ACD initiieren sowie zur Suche nach validen, prädiktiven Auslesemarkern bei der Gefahreneinschätzung von potentiellen Hautsensibilisatoren beitragen.
