Endothelin-1 type A (ETAR) and B receptors (ETBR) belong to the GPCR subfamily A and mediate the actions of their peptide agonist Endothelin-1 (ET-1). ET-1 is one of the most potent vasoconstrictors in the human organism and regulates blood pressure and local and systemic homeostasis. ETAR can be activated not only by ET-1 but also by agonistic antibodies. As recently demonstrated, extracellular binding of agonistic autoantibodies targeting ETAR (ETAR-IgG) promotes downstream signaling through allosteric activation of the receptor, independent of ET-1. The resultant signaling induced severe renovascular disease, exemplified on systemic sclerosis related renal crisis (SSc). Despite their clinical relevance, the potential differences and similarities to natural ligand-mediated activation have not been studied yet. To investigate relevant extracellular loops required for ET-1 and ETAR-IgG binding and downstream signaling responses, each of the three extracellular loops (ECL) was individually mutated. Functional effects were assessed with two different assays. The first GPCR activation assay relied on the MMY yeast model, in which a single human GPCR controls yeast growth to assess the effects of the mutations on ETAR-IgG-mediated ETAR activation. In the second assay, luciferase reporter plasmids enabled monitoring of G-proteins binding to ETAR in response to ET-1 and ETAR-IgG. Change of ECL3 structure resulted in the constitutive activation of ETAR both in MMY yeast model and in luciferase reporter assays. Besides, mutating ECL1 to Alanine or replacing ECL2 demonstrated no effect on ETAR-IgG -induced ETAR activation in yeast GPCR activation assay. In addition, these mutations did not influence ETAR-IgG -mediated Gq/11 and G12/13 binding to ETAR as revealed by luciferase reporter assays. On the contrary, results showed that intact structure of ECL1 and ECL2 is necessary for G12/13 activation upon ET-1 stimulation. This work demonstrates that unlike similar antibodies against other GPCRs, antibodies directed against Endothelin-1 type A receptor do not bind to the extracellular loops of the receptor; thereby eliciting intracellular signaling differences from the natural ligand. Elucidation of these epitopes is a prerequisite for rational design of new potent and more precise pharmacological compounds to replace old, relatively inefficient ones.
Endothelin-1 Typ A (ETAR) und B Rezeptoren (ETBR) gehören zur Unterfamilie A der GPCR und vermitteln die Signale ihres Peptidagonisten Endothelin-1 (ET-1). ET-1 ist einer der stärksten Vasokonstriktoren im menschlichen Organismus und reguliert Blutdruck und lokale und systemische Homöostase. ETAR können nicht nur durch ET-1 aktiviert werden, sondern auch durch agonistische Antikörper. Wie vor kurzem gezeigt, induziert die extrazelluläre Bindung agonistischer Autoantikörper am ETAR (ETAR-IgG) downstream Signaling durch allosterische Rezeptoraktivierung unabhängig von ET-1. Dadurch können schwere renovaskuläre Erkrankungen ausgelöst werden, wie sich am Beispiel der renalen Krise bei Systemischer Sklerose (SSc) zeigt. Trotz ihrer klinischen Bedeutung, wurden die möglichen Unterschiede und Ähnlichkeiten zur Rezeptoraktivierung durch den natürlichen Liganden bisher noch nicht erforscht. Um die für die Bindung von ET-1 und der ETAR-IgG entscheidenden extrazellulären Schleifen und intrazelluläre Signalantworten untersuchen zu können, wurden jede der drei extrazellulären Schleifen (ECL) einzeln mutiert. Funktionelle Effekte wurden mit zwei verschiedenen Assays überprüft. Der erste GPCR Aktivierungsassay beruhte auf einem MMY Hefemodell, bei dem ein einzelner humaner GPCR das Hefewachstum bestimmt. Beim zweiten Assay ermöglichte ein Luziferase-Reporterplasmidassay, die Bindung von G-Proteinen an den ETAR nach Stimulation mit ET-1 und ETAR-IgG zu monitoren. Veränderungen an der Struktur der 3. ECL führten zur konstitutiven Aktivierung des ETAR, sowohl im MMY Hefemodell, als auch im Luziferase-Reporterassay. Dagegen blieben die Mutation zu Alanin an der 1. ECL oder der Ersatz der 2. ECL ohne Wirkung auf die ETAR-IgG -induzierte ETAR Aktivierung im Hefe GPCR Aktivierungsassay. Darüberhinaus beeinflussten diese Mutation die ETAR-IgG vermittelte Bindung von Gq/11 und G12/13 an den ETAR nicht, wie in Luziferase-Reporterassays gezeigt wurde. Im Gegensatz dazu zeigten die Ergebnisse, dass die intakten Strukturen der 1. ECL und 2. ECL für die G12/13 Aktivierung durch ET-1 notwendig sind. Diese Arbeiten zeigen, dass anders als bei ähnlichen GPCR-Antikörpern, die gegen den Endothelin-1 type A Rezeptor gerichtete Antiköper nicht an die extrazellulären Rezeptorschleifen binden. Dadurch ergeben sich Unterschiede zum intrazellulären Signaling des natürlichen Liganden. Die Aufklärung der Bindungsepitope ist die Voraussetzung für die Entwicklung neuer, präziser und wirksamerer Medikamente, um die alten, relativ ineffizienten Arzneien zu ersetzen.
