Einleitung: Die ischämische Herzkrankheit ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Während sich die therapeutische Hypothermie (TH) bei ischämischen Ereignissen wie dem Herzkreislaufstillstand bei Erwachsenen oder der perinatalen Asphyxie als neuroprotektive Therapie etabliert hat, sind die kardioprotektiven Mechanismen der TH bisher nicht vollständig geklärt. Experimentelle Studien zeigen, dass TH den myokardialen Zelluntergang nach Ischämie/Reperfusion (I/R) vermindert, allerdings konnten klinische Studien diese Effekte nicht eindeutig nachweisen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit die zellulären Mechanismen der intra-ischämischen TH (33,5 °C) an Kardiomyozyten untersucht. Dabei wurde zunächst der Einfluss der Hypothermie auf die Einleitung der mitochondrialen Apoptose an HL-1 Zellen analysiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Versuchsprotokoll auf primäre Kardiomyozyten übertragen. Methoden: Die HL-1 Kardiomyozyten und die primären Kardiomyozyten wurden einer sechsstündigen simulierten Ischämie ausgesetzt, bei der die Zellen mit 0,2% Sauerstoff und Mangelmedium (ohne Glukose und ohne Serum) behandelt wurden. Anschließend wurde die Reperfusion simuliert, indem die Zellen bei 21% Sauerstoff und Vollmedium inkubiert wurden. Ein bis drei Stunden nach Beginn der simulierten Ischämie wurden die Kardiomyozyten auf 33,5 °C gekühlt. Für die Analyse der mitochondrialen Apoptose-Einleitung wurden mitochondriale und zytosolische Proteinfraktionen gewonnen. Die mitochondriale Membranintegrität wurde sowohl mittels Western Blot- als auch mit Hilfe einer Fluoreszenzmikroskopischer-Analyse bestimmt. Hierfür wurden die pro-apoptotischen Proteine Cytochrom c, AIF und Bax untersucht und die intrazelluläre Verteilung von Cytochrom c mit der Verteilung der durch MitoTracker Red markierten Mitochondrien verglichen. Außerdem wurden die anti-apoptotischen Proteine Hsp70 und Bcl-2 sowie das Autophagie induzierende LC3-II mittels Western Blot-Analyse bestimmt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der Kühlung auf die Viabilität primärer Kardiomyozyten anhand der Freisetzung von LDH und Troponin T untersucht. Ergebnisse: Intra-ischämische TH verminderte den mitochondrialen Ausstrom der Apoptose-Induktoren Cytochrom c und AIF signifikant. Neben dem Erhalt der mitochondrialen Integrität kam es durch TH zu einer Regulation der anti-apoptotischen Proteine Hsp70 und Bcl-2. Außerdem konnte eine erhöhte Aktivität mitochondrialer Autophagie in gekühlten Zellen beobachtet werden. Bei der Übertragung des Versuchsprotokolls auf primäre Kardiomyozyten konnte gezeigt werden, dass eine frühe Kühlung während der Ischämie die Viabilität der Zellen signifikant erhöhte. Schlussfolgerung: Intra-ischämische TH aktivierte verschiedene Signaltransduktions-wege, die zum Schutz des Mitochondriums während der Reperfusion beitrugen und die Einleitung der mitochondrialen Apoptose signifikant reduzierten. Insbesondere bei der Übertragung des Versuchsprotokolls auf primäre Kardiomyozyten wurde deutlich, dass der frühe Kühlungsbeginn die kardioprotektiven Effekte der Hypothermie entscheidend beeinflusst. Um die klinische Anwendung der Hypothermie zu etablieren, müssen zukünftige Studien die zellulären Effekte der Wiedererwärmung untersuchen.
Abstract Objective: Ischemic heart disease is one of the leading causes of death worldwide. Although, Therapeutic Hypothermia (TH) is an established neuroprotective intervention in patients suffering from cardiac arrest or perinatal asphyxia its protective effects against myocardial ischemia reperfusion (I/R) injury remain to be elucidated. While experimental studies have observed a reduction in myocardial I/R injury due to TH, clinical studies have not been able to show this correlation. Therefore, the aim of this study was to investigate the cellular mechanisms induced by intra-ischemic moderate hypothermia (33.5 °C) in I/R-injured HL-1 cells, with a special focus on mitochondrial apoptosis induction during reperfusion. In order to investigate cardioprotective mechanisms more thoroughly, the protocol of intra-ischemic TH was transferred into a murine primary cardiomyocyte model. Methods: Both HL-1 and primary cardiomyocytes were deprived of oxygen and glucose for 6 hours in glucose/serum-free starvation medium at 0.2% O2. Intra-ischemic cooling was initiated after 1-3 hours of simulated ischemia. Reperfusion was simulated by incubation in complete supplemented medium and 21% O2. Mitochondrial membrane integrity was assessed by Western blot analysis of the pro-apoptotic proteins cytochrome c, AIF and Bax. Furthermore, intracellular localization of cytochrome c was analyzed via immunofluorescence staining and mitochondria were labeled with MitoTracker Red. Moreover, anti-apoptotic Hsp70 and Bcl-2 as well as autophagic activity marker LC3-II were analyzed via Western blot analysis. Finally, the effects of intra-ischemic TH on primary cardiomyocytes viability were assessed by LDH and Troponin T releases. Results: Intra-ischemic TH significantly attenuated the mitochondrial release of cytochrome c and AIF in HL-1 cardiomyocytes during reperfusion. Furthermore, TH promoted an anti-apoptotic effect as assessed by Bcl-2/Bax ratio and Hsp70 protein expression. Moreover, hypothermia induced mitochondrial autophagy during reperfusion. Lastly, intra-ischemic TH significantly increased primary cardiomyocytes viability when initiated one hour after exposure to simulated ischemia as seen in attenuated LDH and Troponin T releases. Conclusion: Early initiation of TH activated multi-modal pathways protecting the mitochondria from I/R-injury. Mitochondria mediated apoptosis was significantly decreased in cardiomyocytes treated with TH. Furthermore, the translation of intra-ischemic TH into a primary cardiomyocyte model emphasized the influence of timetemperature management for cardioprotection. In conclusion, early initiation of TH is crucial for achieving maximal protection against myocardial I/R-induced injury. In order to evaluate TH as a cardioprotective intervention, future studies need to explore the impact of rewarming on cell survival.
