Adeno-associated viruses (AAVs) exhibit a complex biphasic life cycle in cell culture, with productive replication dependent upon co-infection with a helper virus, whereas in the absence of a helper virus AAV latency is established. While vectors based on adeno-associated viruses are already widely used in human gene therapy, open questions remain concerning the regulation of AAV productive and latent infection, especially in the in vivo situation, for which no suitable animal model exists so far. To fill this gap, a combination of in vitro and in silico analyses were chosen in the present thesis to perform a comprehensive analysis of the AAV transcriptome based on state of the art, high-throughput total genomic RNA sequencing. The analysis of the transcription profiles and kinetics of the AAV (+) strand largely confirmed a variety of previous studies performed with classical RNA methods. However, several novel AAV splice variants were identified, the most abundant of which led to the expression of an 18 kDa Rep/VP fusion protein. Genetic analyses with corresponding virus mutants unable to express the newly identified splice variants showed that these have a major impact on early AAV replication steps, highly suggestive of an important role for in vivo AAV propagation. Maybe even more interesting, the AAV transcriptome analysis revealed for the first time the expression of transcripts derived from the AAV (-) strand. These transcripts were encoded in the p5 promoter region, which drives the expression of the large AAV2 regulatory proteins Rep78/68. The pattern of p5 sense and antisense transcription was highly reminiscent of a phenomena described in recent years as bidirectional transcription. This adds a further possible mechanistic level to the regulation of p5 driven gene expression, which represents a major switch point between productive and latent AAV infection. To identify small RNAs with regulatory roles in the AAV life cycle, the first AAV small RNA-Seq analysis was performed in AAV infected cells. A variety of novel AAV2-specific small RNAs located close to or within the AAV- ITRs was identified, which are apparently transcribed from the newly defined anti-p5 promoter. Validation on Northern blots and by argonaute Co-IP indicated alternative small RNA processing, divergent from the canonical miRNA pathway. In addition, small AAV2-specific RNAs in close proximity to viral promoters were suggestive of small promoter-associated RNAs that might act as transcriptional regulators during AAV latent and productive infection. Furthermore, the cellular miRNA expression profile showed no alteration upon AAV infection reassuring the long-established apathogenic nature of wild-type AAV. As a further prerequisite for a better understanding of AAV vector biology, the individual HSV helper genes for productive AAV5 replication were analyzed in a comparative study of the AAV2 and AAV5 replication cycle. This analysis revealed that the same combination of HSV1 helper genes identified for AAV2, promote AAV5 productive replication.
Adeno-Assoziierte Viren (AAV) besitzen einen komplexen biphasischen in vitro Lebenszyklus. Für die produktive Replikation ist AAV auf die Co-Infektion eines Helfervirus angewiesen, während in Abwesenheit eines Helfervirus der latente Zyklus eingeleitet wird. Während von Adeno-Assoziierten Viren abgeleitete Vektoren bereits weitreichend in der humanen Gentherapie eingesetzt werden, bestehen noch offene Fragen bezüglich der Regulation des produktiven und latenten AAV Infektionszyklus, insbesondere zur Regulation in vivo, wofür bisher noch kein geeignetes Tiermodel existiert. Um diese Lücke zu schließen, wurde in der vorliegenden Doktorarbeit eine Kombination aus in vitro und in silico Experimenten angewendet um eine umfassende Analyse des AAV-Transkriptoms durchzuführen, basierend auf einer der aktuellsten RNA- Analysetechniken, der Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS). Die Analyse des Transkriptionsprofils und der Transkriptionskinetik des AAV (+)-Strangs bestätigte weitgehend frühere AAV Transkriptionsstudien, welche mit klassischen RNA-Methoden durchgeführt wurden. Darüber hinaus wurden aber auch verschiedene neue AAV-Spleißvarianten identifiziert, wobei für die am häufigsten vertretende Spleißvariante die Expression eines neuen 18 kDa Rep/VP Fusionsproteins nachgewiesen werden konnte. Genetische Analysen mit Virusmutanten, die diese neue Spleißvariante nicht exprimierten, zeigten, dass diese einen großen Einfluss auf frühe Schritte im AAV Infektionszyklus ausüben, was auf eine wichtige Rolle für die AAV Propagation in vivo hindeutet. Zusätzlich wurden in der AAV Transkriptomanalyse interessanterweise erstmalig Transkripte vom AAV (-)-Strang identifiziert. Diese Transkripte codierten in der p5 Promoterregion, welcher die Expression der großen regulatorischen AAV2 Proteine, Rep78/68 treibt. Das Transkriptionsprofil vom p5 Promoter, in Sense- und Antisense-Richtung, erinnerte an ein in den letzten Jahren beschriebenes Phänomen, bekannt als "bidirektionale Transkription". Dieser Mechanismus könnte eine weitere Ebene für die Regulation der p5 Promoter-Genexpression darstellen, um vom latenten zum produktiven AAV Infektionszyklus umzuschalten. Für die Identifizierung kleinerer RNAs mit regulatorischer Funktion für den AAV Infektionszyklus wurde hier erstmalig eine Illumina Sequenzanalyse kleiner RNAs (small RNA-Seq) von AAV-infizierten Zellen durchgeführt. Hierbei konnten viele kleine AAV2-spezifische RNAs in unmittelbarer Nähe bzw. innerhalb der AAV-ITRs identifiziert werden, welche vermutlich am neu definierten anti-p5 Promoter initiieren. Durch die Validierung mittels Northern-Blot Analyse und Argonaute Co-IP konnte der allgemeine miRNA Prozessierungsmechanismus für die Generierung dieser kleinen AAV2-spezifischen RNAs ausgeschlossen werden. Die unmittelbare Nähe einiger neu detektierter kleiner RNAs zu viralen Promotern lässt allerdings vermuten, dass es sich hierbei um kleine Promoter-assoziierte RNAs handelt, die während des latenten und produktiven Infektionszyklus als Transkriptionsregulatoren fungieren. Weiterhin konnte durch die Analyse des zellulären miRNA-Profils gezeigt werden, dass AAV keinen Einfluss auf die Expression zellulärer miRNAs nimmt, was den lang bekannten apathogenen Charakter von AAV unterstreicht. Weiterhin wurde hier in einer vergleichenden Studie des AAV2 und AAV5 Replikationszyklus die Abhängigkeit der produktiven AAV5 Replikation von den individuellen HSV1 Helfergenen analysiert, als eine Voraussetzung für die Weiterentwicklung der AAV Vektor-Biologie. Dabei konnte gezeigt werden, dass für AAV5 die gleichen HSV Helferfunktionen benötigt werden, wie für AAV2.
