During lactation, the cycle of milk synthesis and removal by suckling or milking causes high hydrostatic pressure differences in the mammary gland. To prevent an uncontrolled exchange of milk, blood and intestinal fluid, the mammary gland tissue maintains the bloodmilk barrier, which on paracellular level is controlled by the tight junction. In previous studies, Markov et al. (2012) found an upregulation of tightening and a downregulation of permeability-mediating tight junction proteins after cessation of milk removal in mice. The present thesis investigated if and how hydrostatic pressure can mechanically affect the mammary epithelial barrier function. With respect to in vivo-approaches as performed by Markov et al. (2012), the present thesis further aimed to analyze pressure induced effects isolated from the influence of milk compounds, in vitro. To accomplish this, a method was successfully established to analyze barrier properties during dynamical changes of hydrostatic pressure. For functional analyses of epithelial barrier properties, the Ussing chamber has been proved to be a powerful experimental technique. Therefore, an Ussing chamber was modified with an additional tube-system to apply hydrostatic pressure to the apical, basal or both sides of an epithelial monolayer, in a range of 1 to 10 kPa. The chamber was provided with a manometer and a syringe to dynamically change the pressure during experiments. Employing the maximal pressure level, stable experimental conditions regarding pH and buffer distribution were confirmed. In the first part of this thesis, effects of negative pressure on the mammary epithelial barrier function were investigated, simulated by increasing basal pressure to monolayers of the mammary epithelial cell line HC11. A combination of different cultivation times (7 and 14 days) and incubation steps (5 and 30 minutes) was employed to further investigate maturing processes and time-dependent adaptation. The basal pressure increase resulted in an immediate and strong decrease of the transepithelial electrical resistance (RT) in all approaches. In parallel, a successive increase of the short circuit current (ISC) was observed during five steps of +1 kPa basal hydrostatic pressure application. Furthermore, a partial recovery was shown in a following equalization step, and the epithelial monolayer integrity was confirmed via immunohistochemical staining of the tight junction. Although the molecular origin remains to be clarified, the obtained data strongly suggest that negative pressure induces protective mechanisms in the mammary epithelial barrier function. To further elucidate possible adaptive mechanisms of the epithelial barrier during milk stasis within lactation, the second part of the thesis focused on bilateral pressure incubation of HC11 monolayers. 14 day-cultivated HC11 cells were incubated with 10 kPa bilateral hydrostatic pressure for 4 hours and compared with hormone induced HC11 cells in a parallel approach, differentiated by treatment with prolactin and dexamethasone. Whereas no significant changes of RT were observed, a decrease of ISC was shown in the differentiated cells, which could partly be inhibited by a barium chloride-induced blockage of inward rectifier potassium channels. Moreover, molecular analyses revealed an upregulation of the scaffolding protein ZO-1 in differentiated cells, which was downregulated after an inhibition with barium chloride. Taken together, it can be assumed by the obtained data that a pressure induced chloride transport possibly was mediated by mechanosensitive transduction, while changes of ZO-1 expression might indicate an interaction of transport and barrier mechanisms. In conclusion, dynamical pressure studies on the mammary epithelial barrier function became assessable by the modified Ussing chamber, which was established as part of this thesis. Moreover, the method may be employed on other cell monolayers and epithelial tissues in future experiments, representing a new tool to study pressure effects, in vitro. From the results acquired in both parts of this thesis, it can be conducted that mammary epithelium reacts to hydrostatic pressure with functional and adaptive processes in barrier function, involving tight junction protein composition and transcellular transport mechanisms. These findings elucidate the physiological processes in mammary barrier function and underline the importance to maintain the blood-milk barrier during pressure conditions induced by suckling, milking and times of milk accumulation in the mammary gland.
Während der Laktation werden durch die Abfolge von Milchsynthese und Milchentnahme hohe Druckunterschiede in der Milchdrüse erzeugt. Um einen unkontrollierten Austausch von Milch, Blut und Gewebsflüssigkeit zu verhindern, bildet das Milchdrüsengewebe die Blut-Milch-Schranke aus, welche auf parazellulärer Ebene von der Tight Junction kontrolliert wird. In vorausgegangenen Untersuchungen fanden Markov et al. (2012) eine Hochregulierung abdichtender und einer Runterregulierung Permeabilität-vermittelnder Tight Junction-Proteine nach einer Unterbrechung der Milchentnahme bei Mäusen. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob und wie hydrostatischer Druck die Barriereeigenschaften von Milchdrüsenepithel mechanisch beeinflussen kann. Mit Bezug zu den von Markov et al. (2012) durchgeführten in vivo-Untersuchungen, hatte die vorliegende Arbeit darüber hinaus zum Ziel druckinduzierte Effekte isoliert vom Einfluss der Milchinhaltsstoffe in vitro zu analysieren. Zu diesem Zweck wurde erfolgreich eine Methode etabliert, mit der Barriereeigenschaften während dynamischer Änderungen von hydrostatischem Druck analysiert werden können. Für die funktionale Analyse epithelialer Barriereeigenschaften hat sich die Ussing-Kammer als hervorragende experimentelle Technik erwiesen. Aufgrund dessen wurde eine Ussing-Kammer modifiziert, so dass damit hydrostatischer Druck zwischen 1 und 10 kPa auf die apikale, basale oder beide Seiten eines einschichtigen Epithels gegeben werden kann. Die Kammer wurde mit einem Manometer und einer Spritze versehen, um den Druck während der Experimente dynamisch anpassen zu können. Stabile experimentelle Bedingungen wurden sichergestellt, indem pH und Pufferverteilung unter maximalen Druckbedingungen getestet wurden. Im ersten Teil der Arbeit wurden die Effekte von Unterdruck auf die Barrierefunktion von Milchdrüsenepithel untersucht, simuliert durch ansteigenden Druck von basal auf konfluenten Zellrasen der Milchdrüsenepithelzelllinie HC11. Eine Kombination aus verschiedenen Kultivierungszeiten (7 und 14 Tage) sowie Inkubationsintervallen (5 und 30 Minuten) wurde verwendet, um Reifungsprozesse und eine zeitabhängige Anpassung näher zu untersuchen. Basaler Druckanstieg resultierte in einem sofortigen und starken Abfall des transepithelialen Widerstandes (RT) in allen Versuchsreihen. Parallel dazu konnte ein sukzessiver Anstieg des Stroms (ISC) als Reaktion auf fünf Zugaben von je +1 kPa basalem hydrostatischem Druck aufgezeigt werden. Zusätzlich wurde während eines anschließenden Druckausgleichs eine anteilige Erholung beobachtet und die epitheliale Integrität mittels immunhistochemischer Färbung der Tight Junction verifiziert. Obwohl der molekulare Ursprung noch geklärt werden muss, legen die erhobenen Daten den Schluss nahe, dass Unterdruck im Milchdrüsenepithel protektive Mechanismen der Barrierefunktion hervorruft. Mit dem Ziel mögliche adaptive Mechanismen der epithelialen Barriere während einer Milchstasis in der Laktation näher zu beleuchten, lag der Fokus des zweiten Teils dieser Arbeit auf beidseitiger Druckinkubation von konfluenten HC11. 14 Tage-kultivierte HC11-Zellen wurden mit 10 kPa beidseitigem hydrostatischem Druck für vier Stunden inkubiert und in einem zweiten Ansatz mit Hormon-induzierten HC11-Zellen verglichen, die durch Behandlung mit Prolaktin und Dexamethason differenziert worden waren. Es wurden keine signifikanten Änderungen des RT beobachtet, aber es wurde eine Abnahme des ISC in differenzierten Zellen gezeigt, welche teilweise durch Bariumchlorid induzierten Block von einwärtsrektifizierenden Kaliumkanälen inhibiert werden konnte. Darüber hinaus wurde in differenzierten Zellen eine Hochregulierung des Gerüstproteins ZO-1 gezeigt, welches nach Bariumchloridzugabe herunterreguliert war. Zusammengefasst unterstützen die erhobenen Daten die Annahme, dass ein Druck verursachter Chloridtransport wahrscheinlich durch Mechanotransduktion vermittelt wurde, während die Änderungen in der Expression von ZO-1 auf eine Interaktion zwischen Transport- und Barrieremechanismen hindeuten. Abschließend kann gesagt werden, dass mit der modifizierten Ussing-Kammer, die als Teil dieser Arbeit etabliert wurde, dynamische Druckstudien an der Barrierefunktion des Milchdrüsenepithels möglich gemacht wurden. Darüber hinaus kann die Methode in zukünftigen Experimenten auch mit anderen Zellrasen und epithelialen Geweben eingesetzt werden, und stellt damit ein neues Werkzeug in dar, um Druckeffekte in vitro zu untersuchen. Aus den Ergebnissen der beiden Teile dieser Arbeit kann geschlussfolgert werden, dass Milchdrüsenepithel auf hydrostatischen Druck mit funktionellen und adaptiven Prozessen der Barrierefunktion reagiert, einschließlich Änderungen des Proteinexpressionsmusters der Tight Junction und zellulärer Transportmechanismen. Die Ergebnisse beleuchten somit die physiologischen Prozesse der Barrierefunktion in der Milchdrüse und unterstreichen die Relevanz der Aufrechterhaltung der Blut-Milch-Schranke, um Druckänderungen durch Säugen, Melken und Milchstau zu begegnen.
