Das Wilmstumorgen WT1 wurde ursprünglich als Tumorsuppressorgen charakterisiert und kodiert ein Zinkfingerprotein. Von den zahlreichen bekannten Proteinvarianten ist es die sog. WT1(-KTS) Isoform, die als Transkriptionsfaktor wirkt. Während der Embryonalentwicklung wird WT1 hauptsächlich im Urogenitalsystem und Mesothel exprimiert, für deren Entwicklung es erforderlich ist. Das GATA4 Gen gehört zu einer Familie von 6 Transkriptionsfaktoren mit dem gemeinsamen Merkmal einer hochkonservierten DNA-Bindungsdomäne, mit der sie an die Nukleotidsequenz (A/T)GATA(A/G) binden. GATA4 wird im Endoderm und Mesoderm sowie daraus abgeleiteten Geweben exprimiert und ist in der Embryogenese unter anderem für die Epikardentwicklung sowie Gonadendifferenzierung erforderlich. WT1 und GATA4 zeigen während der Embryonalentwicklung unter anderem in den Gonaden sowie im Epikard phasenweise ein überlappendes Expressionsmuster. Eine Inaktivierung der Gene sowohl von Wt1 als auch von Gata4 führt in transgenen Mäusen zu ähnlichen Phänotypen mit Störungen der Herz- und Gonadendifferenzierung. Darüber hinaus regulieren beide Proteine gemeinsame gonadale Zielgene. Vor diesem Hintergrund sollte in der vorliegenden Arbeit die Hypothese überprüft werden, dass die Expression des GATA4 Gens durch WT1 reguliert wird. Wt1-defiziente Mausembryonen (Wt1-/-) wiesen einen signifikant reduzierten Gata4 mRNA Gehalt in Herz (ca. 50% Reduktion) und Gonaden (ca. 80% Reduktion) gegenüber Wildtyp Wurfgeschwistern auf. Mithilfe von Immundoppelfluoreszenzfärbungen wurden die WT1 und GATA4 Proteine in epikardialen Zellen von murinen embryonalen Herzen (E12.5) sowie in den Gonaden adulter Wildtyp Mäuse kolokalisiert. In M15-Zellen aus der Mesonephros/Gonaden-Region führte eine Hemmung der Wt1 Expression durch siRNA zu einer Reduktion der Gata4 mRNA um ca. 50%. Diese Resultate zeigen, dass WT1 während der Mausembryogenese für eine normale Expression von GATA4 in den Herzen und Gonaden notwendig ist. Um den zugrundeliegenden molekularen Regulationsmechanismus weiter zu analysieren, wurden Gata4 Promotor-Reporterkonstrukte gemeinsam mit WT1(-KTS) Expressionskonstrukten zellulär kotransfiziert. Ein signifikanter Einfluss von WT1 auf die Aktivität des Gata4 Promotors konnte in diesen Kontransfektionsexperimenten jedoch nicht nachgewiesen werden. Hingegen zeigte der distale Gata4 Enhancer, der für die Ausbildung des lateralen Mesoderms erforderlich ist, eine signifikante Aktivierung durch WT1. Unter Verwendung von Deletionskonstrukten konnte der WT1-sensitive Bereich innerhalb des Gata4 Enhancers auf eine ca. 50 bp lange Sequenz eingegrenzt werden. Die in vivo Bindung von WT1 Protein an die Enhancer-Region in M15-Zellen wurde mittels Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) nachgewiesen. Schließlich konnte im Elektrophoresemobilitätsshiftassay (EMSA) eine Bindung von WT1(-KTS) an den WT1-sensitiven, 50 bp langen Bereich des mesodermalen Gata4-Enhancers belegt werden. Zusammenfassend dokumentieren diese Ergebnisse eine direkte Stimulation des mesodermalen Gata4-Enhancers durch WT1. Damit wurde ein neuer Mechanismus für die Entwicklung des lateralen Mesoderms beschrieben.
The Wilms’ tumor gene WT1 was initially characterized as tumor suppressor gene and is encoding a zinc finger protein. Of the many known protein isoforms it is the WT1(-KTS) isoform which acts as transcription factor. Throughout embryogenesis, WT1 is expressed in the genitourinary system and mesothelium. The GATA4 gene belongs to a family of 6 transcription factors which have in common a highly conserved DNA binding domain that directs binding to the nucleotide sequence element (A/T)GATA(A/G). GATA4 is expressed in the endoderm and mesoderm as well as in derived tissues and needed for epicardial development and gonadal differentiation during embryogenesis. Throughout embryogenesis, WT1 and GATA4 proteins display an overlapping spatio-temporal expression pattern in gonads and epicardium. Transgenic mice with inactivation of the Wt1 and Gata4 genes have similar phenotypes of disrupted cardial and gonadal differentiation. Furthermore, both proteins jointly regulate gonadal genes. The purpose of this study is to verify the hypothesis that the expression of the GATA4 gene is regulated by WT1. Wt1-deficient mouse embryos (Wt1-/-) showed a significant reduction of Gata4 mRNA levels in heart (approx. 50%) and gonads (about 80%) compared to their wildtype littermates. Double immunofluorescent stainings showed revealed a co-localization of both WTt1 and Gata4 GATA4 proteins in murine epicardial cells (e12.5) and in the gonads of adult wildtype mice. Inhibition of Wt1 expression through by siRNA interferences in M15 cells, which are derived from the mesonephros/gonad region, in M15 cells from the mesonephros/gonad region resulted in an approx. 50% reduction of Gata4 mRNA levels. These results show that Wt1 WT1 is essential for normal expression of Gata4 GATA4 in heart and gonads during mouse embryogenesis. To further analyse analyze the regulatory molecular mechanisms, Gata4 promoter reporter constructs were co-transfected along with WTt1(-KTS) expression constructs. WTt1 protein had no significant effect on the Gata4 promoter activity in these co-transfection experiments. However, the distal Gata4 enhancer, required for development of the lateral mesoderm, showed a significant activation by WTt1. By usage of deletion constructs, the WTt1- sensitive region within the Gata4 enhancer could be reduced narrowed down to a 50 bp long sequence. In vivo binding of Wt1 protein to the enhancer region in M15 cells was demonstrated with chromatin immunoprecipitation assay (ChIP). Finally, binding of WTt1(-KTS) to the WTt1- sensitive 50 bp long Gata4 enhancer region was proved by electro mobility shift assay (EMSA). In summary, the results document a direct stimulation of the mesodermal Gata4 enhancer by WTt1. Thereby a new mechanism for the development of the lateral mesoderm has been described.
