Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disease and a prominent health burden that markedly impact patient quality of life, affecting 2-10% of the adult population and 10-30% of children worldwide. Current therapeutic options tackle disease symptoms, but leave the disease’s still poorly understood aetiology seemingly unaltered. Due to its relapsing nature and the associated risk of gaining further, potentially life-threatening, atopic disorders such as asthma and food-allergies, AD presents a notable unmet clinical need on the development of innovative therapeutic strategies. The use of human-based organotypic skin equivalents in basic research is constantly increasing. These, not only circumvent ethical concerns, they also overcome the difficulties of translating results from animal models to humans owing to differences in physiology and anatomy. Despite this however, skin equivalents are still not broadly used in preclinical drug development owing to certain physiological limitations and a lack of model standardisation. This thesis aimed to further develop a previously established skin equivalent in which filaggrin deficiencies, a major component of the known AD pathology, were induced. Firstly, the filaggrin-deficient skin equivalent was used to investigate the therapeutic potential of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists. Supplementation with the PPARα agonist WY14643 led to an up-regulation of filaggrin, normalised free fatty acid distribution, and significantly improved skin barrier function, all of which indicate a probable positive impact upon filaggrin-associated skin diseases like AD. Next, to study the influence of an inflammatory environment on skin cells and barrier homoeostasis, independent of additional factors, the filaggrin-deficient skin equivalent was supplemented with the AD-specific T helper (Th) type 2 cytokines interleukin (IL) 4 and IL 13, alone or in combination. The compensatory up-regulation of skin barrier and tight junction proteins seen following the induction of the filaggrin deficiency was diminished upon cytokine supplementation. This indicates that defects in the equivalent’s skin homoeostasis are not primarily linked to filaggrin deficiency but are, rather, secondarily induced by Th2 inflammation. As AD is a chronic inflammatory skin disease with a fundamental immune component, the contribution of immune cells like T cells is of high interest. Thus, the filaggrin-deficient skin equivalents were supplemented with activated CD4+ T cells applied underneath the dermal layer. This resulted in an inflammatory phenotype, and led to the discovery of an unknown link between thymic stromal lymphopoietin (TSLP), a pro inflammatory cytokine found at intrinsically high levels in the filaggrin-deficient skin equivalent, and the migration of CD4+ T cells in filaggrin-deficient skin. The immunological component instated by either supplementation of the AD-specific Th2 cytokines, or by the implementation of activated CD4+ T cells contributed to the approximation of the in vivo situation. In addition, this thesis revealed several possible applications for human-based skin equivalents and how these can be improved by the implementation of additional cell types. Normal organotypic skin equivalents were used to test the wound healing capacity of different hydrogels modulating wound pH in an attempt to find a new approach for the treatment of chronic wounds characterised by shifted pH values. After application, wounded skin equivalents showed a marked recovery as measured by keratinocyte migration and wound closure. Current in vitro skin equivalents lack of functional vasculature, limiting their preclinical and basic research applications. To gain deeper insight into the crosstalk of keratinocytes and endothelial cells, a normal organotypic skin equivalent was complemented with endothelial cells, resulting in altered keratinocyte proliferation and differentiation, demonstrating the key roles cellular crosstalk plays during skin development. In conclusion, organotypic skin disease equivalent mimicking crucial hallmarks of AD in vitro were developed, and which will enable precise basic research and preclinical drug evaluation for this still poorly understood disease. Moreover, this thesis contributed to the furthered progression of current organotypic skin equivalents towards meeting the requirements of a reliable preclinical test system applicable from cell biology to dermocosmetics, disease modelling, drug development, pathophysiological investigation and regenerative medicine.
Die atopische Dermatitis (AD) ist eine chronisch-entzündliche Hauterkrankung und stellt eine erhebliche, gesundheitliche Belastung dar, die die Lebensqualität der Patienten massiv beeinträchtigt. Sie betrifft 2-10% der erwachsenen Bevölkerung und 10-30% der Kinder weltweit. Momentan verfügbare therapeutische Optionen richten sich gegen die Krankheitssymptome, lassen aber die noch immer wenig verstandene Krankheitsursache außen vor. Aufgrund der hohen Rezidivgefahr und des Risikos, im weiteren Verlauf der Krankheit zusätzliche, potenziell lebensbedrohliche atopische Erkrankungen wie Asthma oder schwerwiegende Nahrungsmittelallergien zu entwickeln, besteht ein großer klinischer Bedarf in der Entwicklung innovativer, therapeutischer Strategien. Die Nutzung humaner Hautmodelle in der Grundlagenforschung steigt kontinuierlich an. Sie bieten nicht nur eine Alternative gegenüber Tierversuchen, die ethisch umstritten sind, sondern haben auch den Vorteil, die durch Unterschiede in der Physiologie und Anatomie von Tier und Mensch bedingte schlechtere Übertragbarkeit von in Tierversuchen generierten Daten zu überwinden. Dennoch finden Hautmodelle aufgrund mangelnder Modellstandardisierung und einiger physiologischer Limitierungen nach wie vor keine breite Anwendung in der präklinischen Arzneimittelentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, ein bereits etabliertes Filaggrin-defizientes Hautmodell weiter zu entwickeln, das die wesentlichen Merkmale der AD-Pathogenese noch realistischer abbildet. Zuerst wurde das Filaggrin-defiziente Hautmodell verwendet, um den positiven Effekt von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptor (PPAR)-Agonisten auf die Verbesserung der Hautbarriere zu untersuchen. Die Zugabe des PPARα-Agonisten WY14643 führte zu einer Hochregulierung von Filaggrin, einer normalisierten Verteilung der freien Fettsäuren und einer signifikant verbesserten Hautbarrierefunktion. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche positive Auswirkung auf Filaggrin-assoziierte Hautkrankheiten wie der AD hin. Um den Einfluss einer entzündlichen Umgebung auf die Hautzellen und die Barrierehomöostase unabhängig von weiteren Einflussfaktoren zu untersuchen, wurde das FLG-defiziente Hautmodell mit für den AD-spezifischen T-Helfer (Th)-Typ-2-Zytokinen Interleukin (IL) 4 und IL 13 versetzt, jeweils allein oder in Kombination. Die kompensatorische Hochregulation von Hautbarriere- und Tight Junction-Proteinen, die nach der Induktion des Filaggrinmangels beobachtet wurde, war nach Zytokinexposition vermindert. Dies deutet darauf hin, dass Defekte in der Hauthomöostase des Modells nicht in erster Linie mit dem Filaggrinmangel in Zusammenhang stehen, sondern sekundär durch eine Entzündungsreaktion ausgelöst werden. Da die AD eine chronisch-entzündliche Hauterkrankung mit einer grundlegenden immunologischen Komponente ist, ist der Einfluss von Immunzellen wie T-Zellen von großem Interesse. Daher wurden die Filaggrin-defizienten Hautmodelle im weiteren Verlauf mit aktivierten CD4+-T-Zellen versetzt, die unterhalb der dermalen Schicht eingebracht wurden. Dies führte zu einem entzündlichen Phänotyp innerhalb des Modells und zur Entdeckung einer unbekannten Verbindung zwischen Thymus stromal lymphopoietin (TSLP), einem proinflammatorischen Zytokin, welches in hohen Konzentrationen in dem Filaggrin-defizienten Hautmodell vorliegt, und der Migration von CD4+-T-Zellen in Filaggrin-defizienter Haut. Die immunologische Komponente, die entweder durch den Zusatz AD-spezifischer Th2-Zytokine oder durch die Implementierung aktivierter CD4+ T-Zellen eingebracht wurde, trug zur Annäherung der in vivo Situation in atopischer Haut bei. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit verschiedene Anwendungsmöglichkeiten humaner Hautmodelle und deren Optimierung durch die Implementierung weiterer Zelltypen aufgezeigt. Humane Hautmodelle wurden verwendet, um die Wundheilungskapazität verschiedener pH-modulierender Hydrogele zu testen und um einen neuen Ansatz für die Behandlung chronischer Wunden zu entwickeln, welche durch veränderte pH-Werte gekennzeichnet sind. Nach der Applikation der jeweiligen Hydrogele zeigten die verwundeten Hautmodelle eine Verbesserung der Wundheilung, gemessen anhand des Wundverschlusses durch die Migration von Keratinozyten. Gegenwärtig verwendeten in vitro Hautmodellen fehlt ein funktionelles Gefäßsystem, was präklinische und grundlegende Forschungsanwendungen einschränkt. Um einen genaueren Einblick in die Zellkommunikation zwischen Keratinozyten und Endothelzellen zu erhalten, wurde ein humanes Hautmodell mit Endothelzellen versetzt, was zu einer veränderten Keratinozytenproliferation und -differenzierung führte. Dies demonstriert die Bedeutung von zellulärem Austausch für die Hautentwicklung. Zusammenfassend wurde ein humanbasiertes Hautkrankheitsmodell entwickelt, das grundlegende Merkmale atopischer Haut in vitro nachahmt und somit zielgerichtete Grundlagenforschung und präklinische Arzneimittelentwicklung für diese noch wenig verstandene Krankheit ermöglichen wird. Darüber hinaus trug diese Arbeit zur Weiterentwicklung humaner Hautmodelle bei, um den Anforderungen an die Nutzung zuverlässiger präklinischer Testsysteme gerecht zu werden – für die Anwendung in der Zellbiologie und Pathophysiologie, der Modellierung von Krankheiten, über der Testung von Kosmetika, der Arzneimittelentwicklung und in der regenerativen Medizin.
