The tight junction (TJ) surrounds epithelial cells in the upper third of the lateral cellular membrane. It is formed by different proteins that are anchored within the membrane of epithelial cells. The most functional relevance is attributed to the family of claudins. The upper epithelial monolayer in the gastrointestinal tract forms a tight barrier between the ingesta and the mammalian organism. While a sufficient nutrient supply must be guaranteed, a tight barrier against potential pathogens must be maintained. Therefore the TJ regulates the paracellular permeability, giving it a direct control over which substances can selectively enter the body. In this thesis the intestinal TJ was analyzed regarding two different aspects of epithelial barrier function. 1\. Challenging porcine intestinal epithelium by predigested and non-predigested milk. Sufficient energy supply via intestinal absorption is essential within the first weeks of life. While an adequate absorption needs to be maintained, a tight intestinal barrier is required for protection against potentially pathogenous organisms. This raises the questions of if and how the intestinal epithelial barrier is regulated during milk consumption. Employing the Ussing chamber technique, jejunal epithelium of 2 month old piglets was incubated with a 50 % milk-buffer mixture. To simulate possible effects due to digestion processes, predigested and non-predigested milk was used. Even though the transepithelial resistance (TER) was significantly increased after 30 and 150 minutes of incubation, no changes of the paracellular permeability for sodium fluorescein could be detected. Analysis of claudin expression levels revealed no changes for claudin-1, -2, -3 and -4. Relocation to intracellular vesicles and subjunctional compartments could be shown for claudin-3 and -4 via immunohistology. Data obtained in this thesis cannot fully explain which milk component leads to the recorded results. However, it can be conducted that as a generalization, milk strengthens the intestinal barrier. 2\. Functional and molecular characterization of the porcine and murine tight junction within small intestinal Peyer’s patches. Peyer’s Patches are responsible for initiating immune reactions when confronted with potential pathogens. They are specialized areas within the mucosa of the distal small intestine and covered by the follicle-associated epithelium (FAE). An important requirement for the controlled interaction between antigens and the immune system is the maintenance of the epithelial barrier integrity of the FAE. Therefore the second part of this thesis focused on the characterization of the FAE. Porcine and murine PP showed higher TER and lower permeability for paracellular markers fluorescein and FITC Dextran (4, 20 kDa) when compared to villous epithelium. Expression levels of different TJ proteins revealed increased levels of sealing claudins. The paracellular localization of claudins was confirmed via immunohistochemistry, and both studies highlight a major significance for claudin-4 in the FAE of PP in interspecies comparisons. The obtained data supports the assumption that PP are clearly specialized for antigen sampling and representation of antigens to the immune system, while the TJ of the FAE provides a stronger seal of the paracellular pathway.
Die Tight Junction (TJ) umschließt Epithelzellen im oberen Drittel der lateralen Zellmembran. Gebildet wird die TJ von verschiedenenin der Zellmembran verankerten Proteinen, wobei den Claudinen die größte funktionelle Bedeutung beigemessen wird. Im Gastrointestinaltrakt bildet die epitheliale Zellreihe die erste Barriere zwischen der Ingesta und dem Organismus des Säugetiers. Während eine ausreichende Absorption der Nährstoffe gewährleistet sein muss, muss eine Barriere gegenüber potentiellen Krankheitserregern aufrechterhalten werden. Die TJ bestimmt hier die parazelluläre Permeabilität und reguliert welche Stoffe zwischen den Epithelzellen aufgenommen werden können. In dieser Dissertation wurde die intestinale TJ hinsichtlich zwei verschiedener Fragestellungen untersucht. 1\. Die Effekte von Milch auf die intestinale epitheliale Barrierefunktion Während die Nährstoffabsorption innerhalb der ersten Lebenswochen für neugeborener Säugetiere essentiell ist, muss außerdem eine ausreichende Barriere aufrechterhalten werden um die Aufnahme von potentiell pathogenen Erregern zu minimieren. Dies wirft die Frage auf, welchen Effekt Milch auf die intestinale Barriere hat. Mittels Ussing Kammer-Technik wurde jejunales Gewebe von Ferkeln mit einer 50 % Milch- Pufferlösung inkubiert. Die Experimente wurden mit vorverdauter und nicht behandelter Milch durchgeführt. Obwohl der transepitheliale Widerstand (TER) innerhalb der ersten 30 Minuten signifikant anstieg und teilweise für 2,5 h konstant erhöht blieb, konnte keine Änderung der Permeabilität für den parazellulären Marker Fluoreszein nachgewiesen werden. Die Expressionsanalyse von Claudin-1, -2, -3 und -4 mittels Immunoblot zeigte keine Veränderung. Mittels immunhistologischer Untersuchungen konnte jedoch gezeigt werden, dass Claudin-3 und Claudin-4 unter der Milchinkubation von der parazellulären Lokalisation unter Kontrollbedingungen abweicht. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse können nicht direkt auf einen Bestandteil der Milch zurückgeführt werden, liefern jedoch eine allgemeine Aussage über den Einfluss von Milch auf die Darmbarriere. 2\. Charakterisierung der epithelialen Barriere in Peyer.s Patches (PP) PP sind spezialisierte Bereiche der Schleimhaut des distalen Dünndarms, welche für die lokale Initiation der Immunantwort auf potentielle Pathogene verantwortlich sind. Sie sind mit follikel-assoziiertem Epithel (FAE) bedeckt. Eine wichtige Voraussetzung für die kontrolliete Interaktion zwischen Pathogenen und Immunsystem ist die epitheliale Integrität des FAE, deren Charakterisierung der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit war. Sowohl porzine, als auch murine PP zeigten einen erhöhten TER, sowie eine geringere Permeabilität für Fluoreszein und FITC Dextran (4, 20 kDa) im Vergleich zum umgebenden resorptivem Dünndarmepithel. Eine verstärkte Expression von abdichtenden TJ Proteinen konnte nachgewiesen werden. Die parazelluläre Lokalisation aller Claudine konnte mittels Immunohistochemie bestätigt werden und beide Studien zeigen, dass Claudin-4 eine speziesübergreifgende Schlüsselrolle im aBereich der Barrierefunktion des PP spielt. Diese gewonnenen Ergebnisse stützen außerdem die bisherige Annahme, dass im Bereich der PP Antigene gebunden und dem Immunsystem präsentiert werden, wohingegen der parazelluläre Weg eine stärkere Abdichtung aufweist.
