Suppressor mutagenesis of CKX1 overexpressing Arabidopsis plants (CKX1ox) led to the identification of the dominant mutants rock2 CKX1ox, rock3 CKX1ox and rock4 CKX1ox (Bartrina 2006), which showed a partial reversion of the cytokinin-deficient phenotype. Using map-based cloning, the rock3 mutant allele was identified as missense mutation in the AHK3 cytokinin receptor gene, and the rock4 mutant allele was identified as a missense mutation in the cytokinin synthesis gene IPT3. It could be shown in a yeast experiment that the rock2 and rock3 mutations cause the formation of constitutively active cytokinin receptors. Phenotypic analysis of the rock2, rock3, and rock4 mutants in the CKX1 overexpressing background revealed that the mutations caused a partial to full reversion of the cytokinin deficiency syndrome in matters of rosette diameter, shoot height, number of siliques, and root growth, and caused delayed leaf senescence in a dark-induced senescence assay. In addition, rock2 CKX1ox and rock CKX1ox plants showed an increased cotyledon diameter and an earlier onset of flowering. In order to analyze the consequences of the rock2, rock3, and rock4 mutations in wild-type background, the 35S:CKX1 transgene was outcrossed. Additionally, transgenic lines expressing rock2, rock3, and rock4 under control of their own promoters were generated in wild-type Arabidopsis plants. The expression of rock2 and rock3 in the transgenic lines was verified by RT-PCR. In most cases, transgenic pAHK2:rock2 and pAHK3:rock3 lines showed more prominent phenotypes compared to rock2 and rock3 mutant plants, indicating a higher cytokinin status in the transgenic lines. For pAHK2:rock2 plants it could be shown that the stronger effects are not due to an extra AHK2 allele in the transgenic lines, but an increased expression level of the transgene compared to wild-type AHK2 expression levels. The rock2 and rock3 mutations caused an enhancement of vegetative and reproductive growth of wild-type plants throughout the plant’s life cycle. Mutants exhibited bigger cotyledons, an increased rosette leaf size, thicker stems and bigger flowers. Microscopic analysis revealed that the increased growth is mainly due to the formation of more cells rather than bigger cells. In addition, the rock3 mutants exhibited the strongest effect in delaying senescence, while the rock2 allele had a greater effect on the onset of flowering. Similar to rock2 and rock3, the rock4 mutant also showed enhanced thickening of stems, a reduced root system, and delayed senescence. Contrary to the rock2 and rock3 mutations, the rock4 mutation did not cause an enhanced cotyledon expansion or an increase in leaf and flower size. Interestingly, rock2, rock3, and rock4 mutant shoots grew and flowered for a longer period of time. Additionally, rock2 and rock3 plants produced more flowers per time unit, which led to a strongly increased number of siliques per plant. This resulted in an increased seed yield per plant, at least in case of pAHK3:rock3 transgenic plants. The size of siliques, number of seeds per silique and seed size were not altered in pAHK3:rock3 transgenic plants. Detailed microscopic analysis of developing embryos revealed that expression of the rock2 or rock4 alleles resulted in a disturbed embryo development and seed abortion. Embryo development was retarded and unsynchronized compared to wild type, and in the case of pAHK2:rock2, embryos were often malformed at developmental stages later than the heart stage. However, a low percentage of mutant embryos developed normally and grew into typical looking pAHK2:rock2 or rock4 plants. Taken together, the rock2, rock3, and rock4 mutations are interesting tools to research the effects of an enhanced cytokinin status during plant development and gave new insight into cytokinin regulated processes. In addition, the characterisation of the gain-of-function cytokinin mutants rock2, rock3, and rock4 revealed that an enhanced cytokinin status causes several effects on plant development, which are of potential interest for agricultural breeding purposes, for example an enhanced organ growth and delayed senescence.
Eine Suppressormutagenese von CKX1-überexprimierenden Arabidopsis Pflanzen (CKX1ox) führte zur Identifikation der dominanten Mutanten rock2 CKX1ox, rock3 CKX1ox und rock4 CKX1ox (Bartrina 2006), welche eine Reversion des cytokinindefizienten Phänotyps zeigten. Die Kartierung der Mutationen ergab, dass es sich bei rock2 und rock3 um Missense-Mutationen in den Cytokinin- Rezeptorengenen AHK2 und AHK3 handelt, und bei rock4 um eine Missense-Mutation im Cytokinin-Synthesegen IPT3. Es konnte mit einem Test in Hefe gezeigt werden, dass die rock2- und rock3-Mutationen zu konstitutiv aktiven Cytokinin- Rezeptoren führen. Eine phänotypische Analyse der rock2-, rock3- und rock4-Mutanten in CKX1-überexprimierenden Pflanzen zeigte, dass die Mutationen bei Rosettendiameter, Sprosshöhe, Anzahl der Schoten und Wurzelwachstum eine partielle bis komplette Reversion des Cytokinindefizienzsyndroms bewirkten und die Blattseneszenz in einem Dunkelheit-induzierten Seneszenztest verzögerten. Außerdem zeigten rock2 CKX1ox und rock3 CKX1ox Pflanzen einen vergrößerten Kotyledonen-Durchmesser und einen früheren Blühzeitpunkt. Um die Auswirkung der rock2-, rock3- und rock4-Mutationen im Wildtyphintergrund zu untersuchen, wurde das 35S:CKX1-Transgen ausgekreuzt. Außerdem wurden transgene Arabidopsis Pflanzen hergestellt, die die rock2-, rock3- und rock4-Gene unter den jeweiligen eigenen Promotoren exprimieren. Die Expression der Transgene rock2 und rock3 wurde mit Hilfe von RT-PCRs nachgewiesen. In den meisten Fällen zeigten die transgenen pAHK2:rock2- und pAHK3:rock3-Pflanzen stärker veränderte Phänotypen im Vergleich zu rock2 und rock3 Pflanzen, was für einen höheren Cytokininstatus in den transgenen Linien spricht. Im Fall von pAHK2:rock2 konnte gezeigt werden, dass die stärkeren Effekte nicht durch ein weiteres AHK2-Allel, sondern durch eine verstärkte Expression des Transgens, verglichen mit dem wildtypischen AHK2-Expressionlevel, ausgelöst wurden. Verglichen mit Wildtyppflanzen bewirken die rock2- und rock3-Mutationen verstärktes vegetatives und reproduktives Wachstum während des gesamten pflanzlichen Lebenszyklus. So bildeten die Mutanten größere Kotyledonen, Rosettenblätter und Blüten und dickere Stängel. Mikroskopische Analysen zeigten, dass die Vergrößerung der Organe im Vergleich zum Wildtyp durch die Bildung von mehr Zellen bewirkt wird. Des Weiteren zeigten vor allem rock3-Mutanten eine verzögerte Seneszenz, während das rock2-Allele eine stärkere Auswirkung auf den Blühzeitpunkt von Arabidopsis-Pflanzen hatte. Die rock4-Mutantion bewirkte, ebenso wie die rock2- und rock3-Mutantionen, dickere Stängel, ein reduziertes Wurzelsystem und verzögerte Seneszenz, aber kein gesteigertes Kotyledonen-Wachstum oder eine Vergrößerung von Rosettenblättern oder Blüten. Interessanterweise zeigten rock2-, rock3- und rock4-Pflanzen eine spätere Termination der Blüte verglichen mit dem Wildtyp. Außerdem produzierten rock2- und rock3-Pflanzen mehr Blüten pro Zeiteinheit, was zu einer stark erhöhten Schotenanzahl und somit zu einem gesteigerten Samenertrag führte. Zumindest war dies bei transgenen pAHK3:rock3-Pflanzen der Fall, da in diesen Pflanzen die Größe der Schoten, die Anzahl der Samen pro Schote und die Samengröße im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert war. Mikroskopische Untersuchungen von sich entwickelnden Embryonen machten deutlich, dass die Expression der rock2- und rock4-Allele zu einer gestörtem Embryo-Entwicklung und einem Abort der Samen führen kann. Die embryonale Entwicklung war verlangsamt und asynchron verglichen mit dem Wildtyp, und im Fall von pAHK2:rock2 waren die Embryos nach Erreichen des Herz-Stadiums außerdem oft missgebildet. Allerdings entwickelte sich ein geringer Prozentsatz der mutanten Embryos normal und adulte Pflanzen zeigten später die für pAHK2:rock2 und rock4 typischen Ausprägungen. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass rock2-, rock3- und rock4-Allele interessante Werkzeuge zur Erforschung von Effekten in der pflanzlichen Entwicklung, ausgelöst durch einen erhöhten Cytokininstatus, darstellen, und neues Licht in Cytokinin-regulierte Prozesse bringen können. Außerdem offenbarte die Charakterisierung der gain-of-function Cytokinin-Mutanten rock2, rock3 und rock4, dass ein erhöhter Cytokininstatus verschiedene Effekte in der pflanzlichen Entwicklung bewirkt, wie zum Beispiel größere Organe und eine verspätete Seneszenz, die von potentiellem Interesse für die Pflanzenzüchtung sind.
