The porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) causes one of the most important infectious disease of pigs. PRRSV infects pigs of all ages, where it causes reproductive failure in sows and respiratory problems in piglets. Usually, symptoms are mild, but lead to reduced weight gain, which causes huge financial losses in the pork industry worldwide. In China even highly pathogenic strains emerged that kill 90% of infected pigs. So far, vaccines failed to eliminate the virus, which is due to the large variation between strains and their ability to escape the immunity of the host. The glycoprotein GP3 consists of an N-terminal signal peptide, a 180 amino acids long and highly glycosylated domain, a hydrophobic conserved region (20 aa) and a variable unglycosylated C-terminal domain (50-60 aa). GP3 is supposed to form a complex with two other glycoproteins (GP2 and GP4) in virus particles, but secretion of the protein from infected cells has also been reported. Here I analyzed the membrane topology of GP3 from type-1 and -2 PRRSV strains. First, Ifound that the N-terminal signal peptide of GP3 (and also from lactate dehydrogenase-elevating virus) is cleaved despite the presence of a carbohydrate in its vicinity. This is in contrast to GP3 of equine arteritis virus where a carbohydrate attached at a similar position prevents processing. Second, I confirmed that a fraction of wild-type GP3 is secreted from transfected cells; GP3 from PRRSV-1 strains (Lelystad, Lena) to a greater extent than GP3 from PRRSV-2 strains (VR-2332, IAF-Klop, XH-GD). This secretion behavior is reversed after exchange of the variable C-terminal domain. In contrast to intracellular GP3, secreted GP3 contains complex-type carbohydrates, indicating that it passed through the secretory pathway. Since intracellular and secreted GP3 have identical SDS-PAGE mobility after deglycosylation, the secreted form is not derived from proteolytic cleavage. Next I used a fluorescence protease protection assay to show that the C terminus of GP3, fused to GFP, is resistant against proteolytic digestion in permeabilized cells. Furthermore, glycosylation sites inserted into the C-terminal part of GP3 are used. Both experiments indicate that the C-terminal part of GP3 is translocated into the lumen of the endoplasmic reticulum. Deletion of the conserved hydrophobic region, but not of the variable C-terminus greatly enhances secretion of GP3. In addition, fusion of the hydrophobic region of GP3 to GFP promotes complete membrane anchorage of this (otherwise soluble) protein. Bioinformatics suggests that the hydrophobic region might form an amphipathic helix. Accordingly, exchanging only a few amino acids in its hydrophilic face prevents and in its hydrophobic face enhances secretion of GP3. Exchanging the latter amino acids in the context of the viral genome did not affect release of virions, but released particles were not infectious. This is consistent with the proposed role of GP3 in virus entry. In sum, GP3 exhibits a very unusual hairpin-like membrane topology. The signal peptide is cleaved and the C-terminus is exposed to the lumen of the ER. Membrane attachment is caused by a short hydrophobic region, which might form an amphiphilic helix. This rather weak membrane anchoring might explain why a fraction of the protein is secreted. We speculate that secreted GP3 might function as a “decoy”, which distracts antibodies away from virus particles.
Das Porzine Reproduktive und Respiratorische Syndrom-Virus (PRRSV) ist einer der bedeutensten Infektionskrankheiten bei Schweinen. PRRSV infiziert Schweine jeden Alters, verursacht Fehl- und Totgeburten bei Säuen und Atemwegserkrankungen bei Ferkeln. In den meisten Fällen sind die Symptome mild, allerdings bei deutlich reduzierter Gewichtszunahme. Dies führt weltweit zu erheblichen finanziellen Einbußen in der Schweinemast. In China sind sogar hoch-pathogene Stämme aufgetaucht, die über 90% der infizierten Schweine töteten. Bisher sind Impfstoffe daran gescheitert, das Virus zu eliminieren. Eine Ursache hierfür sind die starken Variationen zwischen den Stämmen und die Fähigkeit dem Immunsystem des Wirtes zu entkommen. Das Glykoprotein GP3 besteht aus einem N-terminalen Signalpeptid, einer 180 aminosäuren-langen stark glykosylierten Domäne, einem konservierten hydrophoben Bereich (20 Aminosäuren) und einer variablen nicht-glykosylierten C-terminalen Domäne (50-60 Aminosäuren). GP3 formt vermutlich im Viruspartikel einen Komplex mit zwei weiteren Glykoproteinen (GP2 und GP4); es wurde jedoch auch berichtet, dass infizierte Zellen GP3 sekretieren. In dieser Arbeit analysierte ich die Membrantopologie von GP3 aus PRRSV Typ-1 und Typ-2 Stämmen. Als Erstes habe ich entdeckt, dass das N-terminale Signalpeptid von PRRSV-GP3 (ebenso für GP3 vom laktatdehydrogenase-erhöhenden Virus) abgeschnitten wird, unabhängig davon, ob in unmittelbarer Nähe eine Kohlenhydratkette an das Protein gehängt wurde. Dieses Ergebnis unterscheidet sich vom GP3 des Equinen Arteritis-Virus, bei dem eine Kohlenhydratkette an ähnlicher Position die Prozessierung des Signalpeptids verhindert. Zum Zweiten, habe ich bestätigt, dass ein Anteil des GP3 (Wildtyp) von transfizierten Zellen sekretiert wird; GP3 von PRRSV-1 Stämmen (Lelystad, Lena) wird hierbei deutlich stärker sekretiert als GP3 von PRRSV-2 Stämmen (VR2332, IAF-Klop, XHGD). Der Effekt dreht sich um, wenn die variable C-terminalen Domäne entsprechend ausgetauscht wird. Im Unterschied zu intrazellulärem GP3 weist sekretiertes komplexprozessierte Kohlenhydratketten auf. Dies spricht dafür, dass diese Moleküle den sekretorischen Pfad in der Zelle komplett durchlaufen haben. Da intrazelluläres und sekretiertes GP3 nach der de-Glykosylierung die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit in denaturierenden Proteingelen zeigten, wurde die sekretierte Form nicht proteolytisch gespalten. Als Nächstes verwendete ich einen über Fluoreszenz nachgewiesenen Protease-Zugangs-Versuch, um zu zeigen, dass der C-Terminus von GP3 verknüpft mit GFP in permeabilisierten Zellen gegen proteolytischen Verdau geschützt ist. Weiterhin habe ich nachgewiesen, dass in den C-Terminus eingefügte Glykosylierungsstellen genutzt werden. Beide Experimente deuten darauf hin, dass der C-terminale Teil des GP3's ins Lumen des Endoplasmatischen Retikulums transloziert wird. Die Deletion der hydrophoben Region verstärkte die Sekretion von GP3; die Deletion des variablen C-Terminus zeigte diesen Effekt nicht. Weiterhin führte die Verknüpfung der hydrophoben Region von GP3 mit GFP zur kompletten Membranbindung dieses üblicherweise löslichen Proteins. Bioinformatische Analysen sagen voraus, dass die hydrophobe Region eine amphipatische Helix bilden könnte. Dem entsprechend verhinderte der Austausch von einigen Aminosäuren im hydrophilen Bereich die Sekretion von GP3. Der Austausch dieser Aminosäuren im viralen Genom beeinflusste nicht die Freisetzung von Viruspartikeln, allerdings waren diese nicht infektiös. Dieser Befund stimmt mit der GP3 zugewiesenen Rolle beim Virus-Eintritt in die Zelle überein. Zusammengefasst: Gp3 weist eine ungewöhnliche Haarnadel-artige Membrantopology auf. Das Signalpeptid wird abgespalten und der C-Terminus befindet sich im Lumen des Endoplasmatischen Retikulums. Die Membranbindung wird durch eine kurze hydrophobe Region gewährleistet, die wahrscheinlich eine amphipatische Helix bildet. Diese eher schwache Membranverankerung könnte erklären, warum ein Teil dieses Proteins sekretiert wird. Wir spekulieren, dass sekretiertes GP3 als "Köder" benutzt wird, der Antikörper von den Viruspartikeln ablenken könnte.
