Multidrug Resistenz - assoziierte Gene und Proteine in humanen Kolonkarzinomgeweben

Abstract

Für die Entwicklung der Multidrug Resistenz (MDR) sind im wesentlichen das P-Glykoprotein (Pgp), kodiert von mdr1 auf Chromosom 7, das Multidrug Resistenz-assoziierte Protein (MRP), kodiert von mrp, und das Lungen- Resistenzprotein (LRP), kodiert von lrp, beide auf Chromosom 16 lokalisiert, verantwortlich. Es wurden die Expressionsmuster der MDR-assoziierten Proteine und -Gene bei 31 Kolonkarzinompatienten auf Korrelationen untersucht. Es kamen die konventionelle semiquantitative RT-PCR, die Real-Time RT-PCR (Light Cycler System) und die Alkalische-Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase-Methode (APAAP) zur Anwendung. Es ergab sich bei der konventionellen PCR eine eindeutig positive Korrelation für mrp und mdr1. Lrp und mrp, sowie lrp und mdr1 korrelierten schwach positiv. Mit dem Light Cycler ergaben sich eine eindeutig positive Korrelation für lrp und mrp. Für mrp und mdr1 zeigte sich nur eine schwach positive Korrelation, während lrp und mdr1 nicht korrelierten. Die positiven Korrelationen sprechen für eine Co-Regulation der Resistenzgene. Dies trifft besonders für lrp und mrp zu, die beide auf Chromosom 16 lokalisiert sind. Bei den Ergebnissen der Proteine wurden für Pgp und MRP, MRP und LRP, sowie für Pgp und LRP jeweils positive Korrelationen gefunden. Diese Co-Expression der MDR-assoziierten Proteine erschwert die Überwindung der Resistenz mit so genannten Modulatoren. Die Korrelationsanalysen zwischen den Ergebnissen der Gen- (Light Cycler) und der Proteinexpression ergaben für LRP eine eindeutig negative Korrelation Bei MRP und Pgp wurden keine Korrelationen gefunden Es konnte bei keinem der drei Multidrug Resistenz-assoziierten Gene eine Korr. zwischen den beiden verschiedenen PCR-Methoden nachgewiesen werden. Bei den Versuchen auf Transkriptionsebene wurden unterschiedliche cDNA-Präparationen der einzelnen Patientenproben verwendet, was die mangelnde Korrelation erklären könnte. Nur beim Light Cycler kamen für alle Gene die gleichen cDNAs zur Anwendung. Somit sind die Ergebnisse der Real-Time RT-PCR im Vergleich zur semiquantitativen PCR zuverlässiger. Die Quantitative Real-Time RT-PCR ist schneller, reproduzierbarer und genauer als die konventionelle semiquantitative PCR. Letztere erfordert zur Quantifizierung post-PCR Blot-Verfahren, die zeitaufwendig und anfälliger für Kontaminationen sind. Immunhistochemische Methoden bestimmen die Expressionsprofile von Multidrug Resistenz-assoziierten Proteinen auf Einzelzellniveau und können so normale von neoplastischen Zellen unterscheiden. Dies ist bei der Polymerase-Kettenreaktion nicht möglich. Die fehlende Korrelation zwischen Transkriptions- und Translationsebene ist durch verschiedene Faktoren, wie mRNA-Spleißvarianten, mRNA-Stabilität, post- transkriptionelle Regulation der Proteinexpression oder Proteinstabilität erklärbar. Es sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Aussagekraft der Multidrug Resistenz-assoziierten Gene und -Proteine im Bezug auf die Wirksamkeit von Zytostatikatherapien bei Tumorpatienten gänzlich beurteilen zu können.

Multidrug resistance (MDR) is determinated by the increased expression of P-glycoprotein (Pgp) encoded by the mdr1 gene on chromosome 7, the multidrug resistance-associated protein (MRP) encoded by mrp and the lung resistance protein (LRP) encoded by lrp, both located on chromosome 16. We have examined the correlations of the expression of the MDR-associated proteins and genes in colon carcinoma cells of 31 patients. For that we used semiquantitative RT- PCR, real-time RT-PCR (Light Cycler system) and the alkaline phosphatase-anti alkaline phosphatase method (APAAP). Using semiquantitative RT-PCR we found a strong positive correlation for the expression of mrp and mdr1 and weakly positive correlations for lrp and mrp as well as lrp and mdr1. With the Light Cycler System we detected a strong positive correlation for the expression of lrp and mrp, mrp and mdr1 correlated weakly positive, however lrp and mdr1 expression levels didn't correlate at all. The positive correlation suggests a co-regulation of the transcription of the MDR-associated genes. That applies especially to lrp and mrp, located both on chromosome 16. At the protein levels we found positive correlations for Pgp and MRP, MRP and LRP, as well as for Pgp and LRP. This co-express ion of the MDR-associated proteins makes it more difficult to reverse the resistance with modulators. We studied the correlations between mRNA levels (Light Cycler) and protein expression and found a strong negative correlation for LRP, but no correlations for MRP and Pgp. The two different PCR methods showed no correlations regarding the expression of the MDR-associated genes. This lack of correlation could be explained by the use of different cDNA preparations for each patient in the PCR assays. Only with the Light Cycler we used the same cDNAs for all genes. The results of the real-time RT-PCR are therefore more reliable compared to the semiquantitative PCR. Quantitative real time RT-PCR is a rapid, sensitive and reliable method. Semiquantitative PCR requires post PCR handling steps for quantification that are time-consuming and may give rise to contaminations. Immunhistochemical methods however allow detection at the cellular level and differentiation of tumor cells from normal tissues that isn?t possible with PCR assays. The lack of correlation between mRNA and protein levels may be explained by several mechanisms like different mRNA splicing, stability of mRNA, post-transcriptional regulation of the expression of the MDR-associated proteins or stability of the proteins. Further examinations are required to be able to judge completely the importance of MDR-associated genes and proteins regarding the effectiveness of cancer chemotherapy.