Nanocrystals are pure drug particles in the nanometer size range stabilized by proper type and amount of stabilizers. They represent the leading technology for drugs, the formulation of which is problematic due to their low solubility in water and oils, high melting temperature and high molecular weight, because the need for solubilization is obviated by maintaining the drug in a solid crystalline state. Moreover, nanocrystals have a 100% drug loading because no carrier material is used, hence they allow the administration of a high dose of drug in a small volume, a factor which is crucial for e.g. IM or SC administration. With regard to dermal administration, other advantages related to the use of nanocrystals are their increased saturation solubility, resulting in a higher concentration gradient, faster dissolution rate, increased adhesiveness, and potential hair follicle targeting. The increased saturation solubility of nanocrystals was an unexpected and highly-discussed outcome because this factor was considered dependent only on drug’s chemistry, solvent, and temperature. As different increase factors are reported in the literature with regard to saturation solubility of nanocrystals, and since in situ methods are considered more accurate for its determination, a novel in situ method based on UV-vis spectroscopy was utilized to evaluate the extent of the enhanced solubility of nanocrystals of three poorly soluble drugs, dexamethasone, tacrolimus and ibuprofen (chapter 3.1). Wet bead milling was selected as preparation method, and factors affecting the particle size were analyzed. Increasing speed and bead amount and reducing the bead size resulted in smaller nanocrystals, and using different process parameters enabled the preparation of particles with different sizes. The increased saturation solubility of 300 nm-sized nanocrystals was analyzed in situ by adding 2-3 times excess amounts (with regard to the saturation solubility of the micronized drug) to water. The increase factors obtained ranged between 1.3 and 2.8. Particles with a size of ~1 µm were not characterized by increased solubility. The factors of increased solubility measured by our and other different in situ methods reported in the literature were comparable, and were smaller than what was obtained with non in situ techniques. Thus, the use of in situ methods for nanocrystal solubility determination is encouraged. The effect of nanocrystal excess conditions was analyzed with tacrolimus, the solubility of which was extremely low, thereby allowed the use of higher excess conditions without problems related to the background scattering. The maximum obtained factor of increase in solubility was 6.6. Thus, the enhancement with regard to saturation solubility when formulating drugs as nanocrystals is not remarkably high. Therefore, considering dermal application, the concentration gradient between formulation and skin would not markedly increase, and other features may be more relevant to explain the efficiency of nanocrystals in delivering drugs, for instance their dissolution rate. The latter is indeed highly increased by particle size reduction to the nanometer range. This parameter was evaluated during the in situ solubility studies. The effect was extremely remarkable for ibuprofen: the dissolution rate of 0.14 µg/(mL*s) corresponding to 70 µm particles was increased to 4.02 µg/(mL*s) with ~300 nm crystals, thereby an increase factor of ~29 was obtained. The solid state of a drug, i.e. crystalline or amorphous, markedly affects its solubility: the thermodynamically-unstable amorphous state is characterized by the highest saturation solubility and thereby dissolution rate. Milling (grinding) is one of the methods used to generate the amorphous form of a compound because the high energy and shear-rate involved in the process can damage the crystalline structure. In wet bead milling, very high energy forces are used to reduce the particle size. The effect of this process on the solid state of drug nanocrystals and its implications on solubility enhancement was evaluated (chapter 3.2). Wet bead milling for long times (≥2 h) resulted in a reduction of the degree of crystallinity of dexamethasone and tacrolimus nanocrystals. Taking the initial drug powder as 100% crystallinity, the values of degree of crystallinity of the milled particles reached plateaus of ~79 and ~76% for dexamethasone and tacrolimus after 2 and 3 h milling, respectively. The energy involved in the process was not enough for further reduction. The different time needed to achieve the plateaus depended on the brittleness of the drugs, which was determined by the stress-strain curves of the two drugs, which were compared to the ones of very brittle or ductile materials. In comparison to dexamethasone, tacrolimus was more ductile, hence it deformed plastically before it started to break. The effect of freeze-drying, a commonly used drying technique for nanocrystals, on the degree of crystallinity of nanocrystals was also evaluated. A further reduction in crystallinity was obtained, and the effect of the milling process on the solid state was thereby evened. Finally, the implications of reduced crystallinity on saturation solubility of nanocrystals were analyzed in situ in combination to the effect of nanosize. The highest increase in saturation solubility was always obtained with the lowest degree of crystallinity, and not with the smallest particle size. This was observed with tacrolimus, for which the highest solubility increase (factor 1.7) was obtained for particles milled for 5 h, the degree of crystallinity of which was the lowest obtained, 76%, but their average particle size was 527 nm, hence larger than particles milled for a shorter time, but the degree of crystallinity of which was higher and resulted in a lower solubility increase. Although a reduced crystallinity has positive implications on solubility enhancement, alterations to drug solid state during product shelf-life are not acceptable. Thus, the selection of proper parameters (e.g. reduced speed, increased medium viscosity) is suggested to preserve the solid state of the drug throughout the milling process and during product shelf-life. The evidence that the reduced degree of crystallinity contributed to the increase in saturation solubility of nanocrystals suggested that the maximum solubility enhancement, the clinical relevance of which may be hence higher, could be obtained by combining amorphous solid state and nanosize by preparation of amorphous nanoparticles (chapter 3.3). Indomethacin was the model drug used because it is a stable glass former. Wet bead milling was selected as preparation method and the challenge represented by water as medium, promoting recrystallization, was tackled by finding a proper formulation stabilizing both the amorphous solid state and the particle size. Polyvinylpyrrolidone (PVP, Kollidon 30) was compared to poloxamer 407 as stabilizer. PVP was able to stabilize the amorphous solid state throughout the milling process, however, the particles did not remain in the nanometer range after redispersion of the freeze-dried powder. Poloxamer 407 acted oppositely: it stabilized the particle size, but not the amorphous solid state, and the particles recrystallized during milling. Combining the two polymers together was also not successful, as the amorphous state converted to the crystalline one upon nanomilling. Thus, it was hypothesized that the presence of two large polymers competing for surface coverage was the problem: PVP could not sufficiently cover the particle surface because of the steric impediment of poloxamer 407, thereby a lack of protection against recrystallization occurred. Poloxamer was thus replaced by a small surfactant, sodium dodecyl sulfate (SDS), which showed a synergism with PVP: this combination stabilized both the amorphous solid state and the particle size. Thus, the formulation necessary, and hence suggested, for stabilization of amorphous nanoparticles in a preparation process involving water, consists in the combination of a polymer acting as anti-recrystallization agent and a small molecule preserving the particle size in the nanometer range. The effect of amorphous state and nanosize on saturation solubility and dissolution rate was tested during in situ studies. The amorphous solid state and the nanonization of indomethacin alone had similar increase factors with regard to solubility (~2.4), while the dissolution rate was more enhanced in the case of nanocrystals. The greatest increase in both saturation solubility and dissolution rate was, however, obtained for amorphous nanoparticles, with a factor of increase of 5.2 for saturation solubility, while the dissolution rate reached 2.328 μg/(mL*s), markedly higher than what was obtained in the other cases. It was thus demonstrated that the combination of amorphization and nanonization provides a synergism with regard to both saturation solubility and dissolution rate. This effect has the potential for being therapeutically relevant in case of, but not limited to, dermal application, especially for drugs, the amorphization of which already consistently increases dissolution rate and solubility, which could be further enhanced by their nanonization. Finally, a novel nanocarrier which would allow controlled drug release from nanocrystals was obtained by nanoencapsulating dexamethasone nanocrystals within a shell of water insoluble polymers by the solvent evaporation method (chapter 3.4). The polymers selected were Eudragit® RS 100 and ethyl cellulose. Wet bead milling of dexamethasone was performed in dichloromethane, and nanocrystals with a size of ~350 nm were obtained, demonstrating the feasibility of milling in organic solvents for nanocrystal preparation. After optimal process conditions were determined during preparation of blank polymer nanoparticles, the organic nanosuspension was emulsified with water or with an aqueous solution of polyvinyl alcohol (PVA) (for Eudragit® and ethyl cellulose, respectively) and the solvent was afterwards removed during overnight stirring. Polymer concentration of 2% (w/v) resulted in nanocapsules with a particle size of ~250 nm. The reason for the smaller particle size of nanocapsules compared to nanocrystals was the simultaneous formation of blank nanoparticles in the nanocapsule sample, and the presence of dissolved polymer covering the surface of nanocrystals, hence increasing the particle size measured by PCS. The successful nanoencapsulation of dexamethasone nanocrystals within a polymer shell was confirmed by morphology studies, FTIR, stability of particle size upon dilution below the drug solubility and, most relevant, dissolution studies. After an initial burst due to the presence of non-encapsulated nanocrystals, the drug release from nanocapsules was controlled over time in comparison to the one of a regular nanosuspension. A novel nanocarrier for the treatment of diseases which require prolonged exposure to the drug was thereby obtained and characterized. Indeed, a depot formulation for the treatment of, for instance, skin diseases like psoriasis via intradermal injection of this type of nanocarrier would be possible. Moreover, organic solvents may be replaced by oils or semisolids, and this method could thus be used for preparation of dermal nanocrystals directly in their final dosage form, saving time and costs.
Nanokristalle sind reine Arzneistoffpartikel im Nanobereich, die durch geeignete Art und Menge eines Stabilisators stabilisiert werden. Sie repräsentieren die führende Technologie für Arzneistoffe, deren Formulierung aufgrund ihrer niedrigen Löslichkeit in Wasser und Ölen, hohen Schmelztemperaturen und hohen Molekulargewichten problematisch ist, zumal die Solubilisation vermieden wird, da der Arzneistoff in fester kristalliner Form erhalten bleiben muss. Zudem haben Nanokristalle aufgrund fehlendem Arzneistoffträger eine Arzneistoffbeladung von 100%, wodurch große Arzneistoffdosen in kleinen Volumina appliziert werden können, welches einen kritischen Faktor bei beispielsweise intramuskulärer oder subkutaner Administration darstellt. Insbesondere in Hinsicht auf eine dermale Applikation bieten sich weitere Vorteile wie höhere Konzentrationsgradienten, schnellere Freisetzungsraten, erhöhte Haftfähigkeit und ein potentielles Haarfollikel-Targeting. Die erhöhte Sättigungslöslichkeit der Nanokristalle stellte ein unerwartetes und stark diskutiertes Ergebnis dar, da dieser Faktor ausschließlich durch die chemischen Eigenschaften des Arzneistoffs, des entsprechenden Lösungsmittels und der Temperatur beeinflusst werden sollte. Da von unterschiedlichen Erhöhungsfaktoren in der Literatur in Hinsicht auf Sättigungslöslichkeit von Nanokristallen berichtet wird, und da die Bestimmung mit in situ Methoden als genauer angesehen wird, wurde eine neue, auf UV-Vis Spektroskopie basierende in situ Methode verwendet, um das Ausmaß der erhöhten Löslichkeit von Nanokristallen der drei schwer löslichen Arzneistoffe Dexamethason, Tacrolimus und Ibuprofen zu bestimmen (Kapitel 3.1). Nassperlenvermahlung wurde als Herstellungsmethode gewählt, und Faktoren, die die Partikelgröße beeinflussen, wurden analysiert. Eine Erhöhung der Geschwindigkeit und der Menge an Mahlperlen und eine Verringerung der Mahlperlengröße führte zu kleineren Nanokristallen, und die Anwendung von verschiedenen Prozessparametern ermöglichte eine Herstellung von Partikeln mit verschiedenen Größen. Die erhöhte Sättigungslöslichkeit von Nanokristallen mit einer Größe von 300 nm wurde in situ analysiert, indem ein 2-3-facher Überschuss (basierend auf der Sättigungslöslichkeit von mikronisiertem Arzneistoff) in Wasser gegeben wurde. Die Erhöhungsfaktoren lagen im Bereich zwischen 1,3 und 2,8. Partikel mit einer Größe von ungefähr 1 µm wurden nicht durch eine erhöhte Löslichkeit charakterisiert. Die Faktoren der erhöhten Löslichkeit, die mit unserer und anderen verschiedenen in der Literatur veröffentlichten in situ Methoden gemessen wurden, waren vergleichbar, und waren gleichzeitig niedriger als die Werte, die mit nicht-in situ Methoden gemessen wurden. Daher wird die Verwendung von in situ Methoden für die Bestimmung von Nanokristall-Löslichkeiten empfohlen. Der Einfluss von Nanokristall-Überschuss-Bedingungen wurde mit Tacrolimus analysiert, dessen Löslichkeit extrem niedrig ist und somit höhere Überschuss-Bedingungen möglich waren, ohne Probleme durch eine Hintergrundstreuung hervorzurufen. Der höchste erhaltene Faktor der Löslichkeitssteigerung war 6,6. Daher ist die Erhöhung in Hinsicht auf die Sättigungslöslichkeit bei Arzneistoffformulierungen basierend auf Nanokristallen nicht außergewöhnlich hoch. Bei dermaler Applikation würde der Konzentrationsgradient zwischen der Arzneistoffformulierung und der Haut nicht stark gesteigert werden, weshalb andere Faktoren relevanter sein müssen, um die Wirkstoffzufuhr-Effizienz von Nanokristallen erklären zu können, wie beispielsweise ihre Freisetzungsrate. Letztere wird tatsächlich deutlich durch Partikelgrößenverkleinerung im Nanobereich erhöht. Dieser Parameter wurde während den in situ-Löslichkeitsstudien untersucht. Der Einfluss war für Ibuprofen außergewöhnlich hoch: die Freisetzungsrate von 0.14 µg/(mL*s) von Partikeln einer Größe von 70 µm wurde auf 4.02 µg/(mL*s) mit Kristallen einer Größe von ~300 nm gesteigert, was einem Faktor von ~29 entspricht. Der feste Zustand eines Arzneistoffes, genauer kristallin oder amorph, hat einen großen Einfluss auf seine Löslichkeit: der thermodynamisch-instabile amorphe Zustand wird durch die höchste Sättigungslöslichkeit und somit die höchste Freisetzungsrate charakterisiert. Mahlen (Schleifen) stellt eine der Methoden dar, um amorphe Formen eines Stoffes herzustellen, da der hohe Energieeintrag und Scherkräfte, die in den Prozess involviert sind, die kristalline Struktur beschädigen können. Bei der Nassperlenvermahlung werden sehr hohe Energiekräfte verwendet, um die Partikelgröße zu reduzieren. Die Auswirkung dieses Prozesses auf den Festzustand der Arzneistoff-Nanokristalle und seinen Einfluss auf Löslichkeitserhöhung wurde ausgewertet (Kapitel 3.2). Nassperlenvermahlung über einen längeren Zeitraum (≥2 Stunden) resultierte in einer Reduktion des Kristallinitätsgrades von Dexamethason- und Tacrolimus-Nanokristallen. Mit einer initialen 100%-Kristallinität des Arzneistoffpulvers erreichte der Kristallinitätsgrad der gemahlenen Partikel Plateaus von ~79 und ~76% für Dexamethason und Tacrolimus nach einer Mahldauer von 2 und 3 Stunden. Die eingebrachte Energie des Prozesses war nicht ausreichend, um die Kristallinität weiter zu reduzieren. Die abweichende Zeit, die benötigt wurde, um die jeweiligen Plateaus zu erreichen, ergab sich aus der Sprödigkeit der Arzneistoffe, die anhand von Spannungs-Dehnungs-Diagrammen der beiden Arzneistoffe bestimmt wurde, die mit Diagrammen von sehr spröden oder dehnbaren Materialien verglichen wurden. Im Vergleich mit Dexamethason war Tacrolimus duktiler, weshalb es plastisch verformt wurde, bevor es zum Bruch des Materials kam. Der Einfluss von Gefriertrocknung, die eine übliche Trocknungsmethode für Nanokristalle darstellt, auf den Kristallinitätsgrad wurde ebenfalls untersucht. Eine weitere Reduktion der Kristallinität wurde erhalten, und der Einfluss des Mahlvorgangs auf den Festzustand wurde somit ausgeglichen. Schließlich wurden die Auswirkungen einer reduzierten Kristallinität auf die Sättigungslöslichkeit von Nanokristallen in situ analysiert, kombiniert mit dem Einfluss von Partikelgrößen im Nanobereich. Die höchste Steigerung der Sättigungslöslichkeit wurde immer mit dem niedrigsten Kristallinitätsgrad erhalten, und nicht mit der niedrigsten Partikelgröße. Dieser Effekt wurde mit Tacrolimus beobachtet, für das die höchste Löslichkeitssteigerung (Faktor 1,7) bei Partikeln erhalten wurde, die für 5 Stunden gemahlen wurden, den niedrigsten Kritallinitätsgrad aufwiesen (76 %), aber deren mittlere Partikelgröße bei 527 nm lag, was deutlich größer war als die von Partikeln, die für kürzere Zeit gemahlen wurden, aber deren Kristallinitätsgrad höher war und niedrigere Löslichkeitssteigerungen aufwiesen. Obwohl eine reduzierte Kristallinität positive Auswirkungen auf die Löslichkeitsverbesserung hat, sind Veränderungen des Festzustands des Arzneistoffes während der Haltbarkeitsdauer des Produktes nicht akzeptabel. Daher wird eine Auswahl von passenden Parametern (z. B. reduzierte Geschwindigkeit, erhöhte Viskosität des Mediums) empfohlen, um den Festzustand des Arzneistoffes während des Mahlprozesses und der Haltbarkeitsdauer zu erhalten. Der Beweis, dass der reduzierte Kristallinitätsgrad zur Steigerung der Sättigungslöslichkeit beiträgt, legt nahe, dass die maximale Löslichkeitssteigerung, deren klinische Relevanz dann höher sein könnte, durch eine Kombination von amorphem Festzustand und Partikelgrößen im Nanobereich durch die Herstellung von amorphen Nanokristallen erreicht werden könnte (Kapitel 3.3). Indomethacin wurde als Modellsubstanz verwendet, da es ein stabiler Glasbildner ist. Nassperlenvermahlung wurde als Herstellungsmethode gewählt, und die Herausforderung, Wasser als Medium zu verwenden, das selbst die Rekristallisation fördert, wurde angegangen, indem eine passende Formulierung gesucht wurde, die neben dem amorphen Zustand auch die Partikelgröße stabilisiert. Polyvinylpyrrolidon (PVP, Kollidon 30) wurde mit Poloxamer 407 als Stabilisator verglichen. PVP konnte den amorphen Zustand über den gesamten Mahlprozess stabilisieren, allerdings gewährleistete es nicht die Aufrechterhaltung der Partikelgrößen im Nanobereich nach Redispergieren des gefriergetrockneten Pulvers. Poloxamer 407 hingegen zeigte die entgegengesetzte Wirkung: es stabilisierte die Partikelgröße, aber nicht den amorphen Zustand, wodurch die Partikel während des Mahlens rekristallisierten. Die Kombination der beiden Polymere war ebenfalls nicht erfolgreich, da durch den Mahlvorgang der amorphe Zustand in den kristallinen überging. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Vorhandensein zweier großer Polymere, die um die Oberflächenanlagerung konkurrieren, das Problem darstellte: PVP konnte die Oberfläche durch die sterische Hinderung von Poloxamer 407 nicht ausreichend bedecken, wodurch es zu einem verringerten Schutz gegen Rekristallisation kam. Poloxamer wurde deshalb durch ein kleines Tensid ersetzt, Natriumdodecylsulfat (SDS), welches einen Synergismus mit PVP aufwies: diese Kombination stabilisierte neben dem amorphen Festzustand auch die Partikelgröße. Daher ist es nötig und wird hiermit empfohlen, dass eine Formulierung zur Stabilisierung amorpher Nanopartikel in einem Herstellungsprozess, in dem Wasser beteiligt ist, eine Kombination aus einem Polymer als Anti-Rekristallisationsmittel und einem kleinen Molekül zur Erhaltung der Partikelgröße im Nanobereich enthält. Der Effekt des amorphen Zustands und die Partikelgröße im Nanobereich auf die Sättigungslöslichkeit und die Freisetzungsrate wurde mit in situ Studien getestet. Der amorphe Zustand und die Verkleinerung der Partikelgröße in den Nanobereich von Indomethacin hatten jeweils einen ähnlichen Einfluss auf die Löslichkeit (~2,4), während die Freisetzungsrate im Fall der Nanokristalle stärker erhöht wurde. Die größte Steigerung der Sättigungslöslichkeit und der Freisetzungsrate wurde für amorphe Nanokristalle erreicht, mit einem Steigerungsfaktor von 5,2 für die Sättigungslöslichkeit, während die Freisetzungsrate einen Wert von 2,328 µg/(mL*s) erreichte, was deutlich höher als in anderen Fällen war. Es wurde somit demonstriert, dass die Kombination von Amorphisierung und Nanonisation einen Synergismus bietet im Hinblick auf Sättigungslöslichkeit und Freisetzungsrate. Dieser Effekt hat das Potential, um im Fall von dermaler Applikation, aber nicht ausschließlich darauf beschränkt, therapeutisch relevant zu sein, insbesondere für Arzneistoffe, deren Amorphisierung bereits die Freisetzungsrate und Löslichkeit erhöht, die durch Nanonisierung weiter erhöht werden könnten. Abschließend wurde ein neuer Nanoträger erhalten, der eine kontrollierte Arzneistofffreisetzung aus Nanokristallen erlauben würde, indem Dexamethason-Nanokristalle in wasserunlöslichen Polymeren anhand der Lösungsmittelverdampfungsmethode nanoverkapselt wurden (Kapitel 3.4). Die gewählten Polymere waren Eudragit® RS 100 und Ethylzellulose. Nassperlenvermahlung von Dexamethason wurde in Methylenchlorid durchgeführt, was die Machbarkeit des Mahlens in organischen Lösungsmitteln zur Herstellung von Nanokristallen zeigte. Nachdem optimale Prozessbedingungen für unbeladene Polymernanopartikel erhalten wurden, wurde die organische Nanosuspension in Wasser oder einer wässrigen Polyvinylalkohollösung (PVA) (für Eudragit® und Ethylzellulose) emulgiert und das Lösungsmittel anschließend über Nacht unter Rühren entfernt. Eine Polymerkonzentration von 2 % (w/v) resultierte in Nanokapseln mit einer Partikelgröße von ungefähr ~250 nm. Der Grund für die kleinere Partikelgröße von Nanokapseln im Vergleich zu Nanokristallen war die gleichzeitige Bildung von reinen Nanopartikeln in der Nanokapselprobe, und das Vorhandensein von gelöstem Polymer, das die Oberfläche der Nanokristalle bedeckt, wodurch die mit PCS gemessene Partikelgröße erhöht wurde. Die erfolgreiche Nanoverkapselung von Dexamethason-Nanokristallen in einer Polymerhülle wurde durch Morphologiestudien, FTIR, Stabilität der Partikelgröße nach Verdünnung unterhalb der Arzneistofflöslichkeit und, insbesondere, durch Freisetzungsstudien bestätigt. Nach einem initialen Burst, hervorgerufen durch das Vorhandensein von nicht-verkapselten Nanokristallen, wurde die Arzneistofffreisetzung über die Zeit im Vergleich zu einer regulären Nanosuspension kontrolliert. Ein neuer Nanoträger für die Behandlung von Erkrankungen, die eine langfristige Arzneistofffreisetzung erfordern, wurde somit erhalten und charakterisiert. Eine Depot-Formulierung für die Behandlung von beispielsweise Hauterkrankungen wie Psoriasis via intradermaler Injektion dieses Nanoträgertyps wäre somit möglich. Außerdem könnten organische Lösungsmittel durch Öle oder halbfeste Zubereitungen ersetzt werden, wodurch eine direkte Herstellung von dermalen Nanokristallen in ihrer finalen Arzneiform und somit die Einsparung von Zeit und Kosten ermöglicht werden würde.
