In vitro differentiation of chondrogenic cells in three-dimensional scaffold- assisted culture for cartilage repair and characterization of cartilage sources

Abstract

Neither hyaline articular cartilage nor the fibrocartilage of the intervertebral disc have a sufficient self-healing potential. In the long term, cartilage injuries lead to osteoarthritis (OA) or degenerative intervertebral disc disease. With the help of cartilage tissue engineering techniques, combining chondrocytes or chondrogenic progenitor cells such as mesenchymal stromal cells (MSCs) with a supportive matrix (scaffold), cartilage cell implants could be produced to improve cartilage defect healing. To evaluate the influence of highly porous alginate-based scaffolds functionalized with chondroitin sulfate (CS) on the cartilage formation (chondrogenesis) by MSCs, the cell adherence, survival and expression of cartilage matrix proteins of MSCs and chondrocytes were analyzed. In the second subpart of the study, a decellularization protocol was established to prepare and optimize a cell-free scaffold made of a natural intervertebral disc-derived extracellular matrix (ECM) from disc tissue. Subsequently, the acellular IVD-derived ECM was repopulated either with allogenic MSCs or IVD cells to compare the reseeding efficacy, cell viability as well as to quantify the collagen and sGAG. The third part of the study focused on the comparative characterization of hip cartilage and chondrocytes derived from patients suffering from OA or femoral neck fracture (FNF). A macroscopic in-house scoring system was established and validated to grade OA associated cartilage alterations. The alginate scaffolds allowed the growth of MSCs and the synthesis of an ECM that contained cartilage-specific type II collagen. The CS functionalization resulted in an increased sGAG synthesis compared with the CS-free scaffolds. The cell-free IVD-ECM was established and successfully re- colonized with MSCs and IVD cells after pretreatment with serum albumin. The total collagen content in the MSCs populated constructs was higher than in those containing IVD cells. The in-house scoring system was suitable for detection of OA changes, differed between the two cartilage sources and correlated with histological Mankin score. Cells isolated from OA cartilage showed differences in phenotype compared with cells isolated from the FNF. The results of this study demonstrated two fundamentally different approaches for obtaining tissue-engineering cartilage implants and help with the assessment of chondrocytes for experimental purposes, which are isolated from the femoral head cartilage discarded after implantation of an endoprosthesis.

Weder der hyaline Gelenkknorpel noch der Faserknorpel der Bandscheibe verfügen über ein ausreichendes Heilungspotential. Langfristig führen Knorpelverletzungen daher zu Arthrose oder Bandscheibendegeneration. Über das Knorpel-Tissue Engineering, bei dem Knorpelzellen oder zu Knorpelzellen differenzierbare Vorläuferzellen wie mesenchymale Stromazellen (MSCs) mit einer Trägermatrix (Scaffold) kombiniert werden, könnten Knorpelzellimplantate für den Knorpelersatz zur Verbesserung der Heilung gewonnen werden. Um den Einfluss von hochporösen Alginat-basierten Scaffolds, die mit Chondroitinsulfat (CS) funktionalisiert wurden, auf die Knorpelbildung (Chondrogenese) mesenchymaler Stromazellen (MSCs) zu beurteilen wurde die Zelladhärenz, das Zellüberleben und die Expression von Knorpel-Matrixproteinen von MSCs und Chondrozyten im Alginatscaffold analysiert. In der zweiten Teilstudie wurde zur Herstellung eines Scaffolds aus natürlicher extrazellulärer Matrix (ECM) eine Zellbefreiung (Dezellularisierung) von Bandscheiben- gewebe etabliert und optimiert. Anschließend wurde die Rekolonisation der dezellularisierten ECM mit MSCs im Vergleich zu Bandscheibenzellen vorgenommen. Die dritte Teilstudie beschäftigte sich mit der vergleichenden Charakterisierung von Hüftkopf- knorpel und aus diesem gewonnenen Knorpelzellen von Patienten mit Arthrose oder Schenkelhalsfraktur. Dieser findetsehr oft für die Zellisolierung für experimentelle Zwecke Verwendung. Zur Beurteilung der Arthrose- assoziierten Veränderungen wurde ein makroskopisches in-house Scoring-System etabliert und validiert. Die Alginatscaffolds erlaubten das Wachstum der MSCs und die Synthese einer ECM, die knorpelspezifisches Kollagen Typ II enthielt. Die Chondroitinsulfat- Funktionalisierung führte zu einer erhöhten Proteoglykansynthese im Vergleich zu den CS-freien Scaffolds. Es konnte eine zellfreie Bandscheiben-ECM hergestellt und nach Vorbehandlung mit Serumalbumin, erfolgreich mit MSCs und IVD-Zellen rekolonisiert werden, wobei der Gesamtkollagengehalt in den mit MSCs besiedelten Konstrukten höher war. Das in-house Score System war zur Erfassung arthrotischer Veränderungen geeignet, unterschied zwischen beiden Knorpelquellen (Arthrose und Schenkelhalsfraktur) und korrelierte mit dem histologischen Mankin-Score. Aus dem Knorpel von Coxarthrose- Patienten isolierte Zellen wiesen gegenüber den nach Schenkelhalsfraktur isolierten Zellen Unterschiede im Phänotyp auf. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen zwei grundsätzlich verschiedene Ansätze für die Gewinnung tissue-engineerter Knorpelimplantate auf und helfen bei der Beurteilung von Knorpelzellen für experimentelle Zwecke, die aus dem nach Implantation einer Endoprothese anfallendem Hüftkopfknorpel isoliert werden.