dc.contributor.author
Hanna, Jennifer
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:14:48Z
dc.date.available
2011-11-22T10:21:06.842Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2258
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6459
dc.description.abstract
Fehlgefaltete Proteine werden im Endoplasmatischen Retikulum (ER) aussortiert
und in einem Vorgang, der als ER-assoziierte Protein-Degradation (ERAD)
bezeichnet wird, dem Ubiquitin-Proteasom-Abbauweg im Cytosol zugeführt. In
Hefe spielt dabei der HRD-Komplex eine zentrale Rolle. Dieser Ubiquitinligase-
Komplex besteht aus der RING-Finger E3-Ubiquitinligase Hrd1 und ihrem
Interaktionpartner Hrd3, Der1, das durch Usa1 rekrutiert wird, und Yos9. Das
Substrat-erkennende Protein Yos9 bindet auf der luminalen Seite des Komplexes
an die luminale Domäne des Membranproteins Hrd3. Hrd3 interagiert mit ERAD-
Substraten unabhängig von ihrem Glykosylierungsstatus, während Yos9
spezifische Oligosaccharidstrukturen gebundener Substrate erkennt, die eine
Fehlfaltung signalisieren. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der
Protein-Protein-Interaktionen zwischen Usa1 und Hrd1 sowie zwischen Yos9 und
Hrd3. Darüber hinaus sollten Einblicke in die molekulare Struktur dieser
Proteine gewonnen werden. Die direkte Interaktion zwischen den cytosolischen
Domänen von Usa1 und Hrd1 wurde mit biophysikalischen Methoden in vitro
nachgewiesen. Die Proteine assoziieren in einer 1:1-Stöchiometrie mit einer
Dissoziationskonstante im oberen nanomolaren Bereich. Der
Oligomerisierungszustand des Komplexes konnte nicht zweifelsfrei bestimmt
werden. Während die Masse des Komplexes im statischen Lichtstreu-Experiment
auf eine 2+2-Assoziation hindeutet, entspricht sie in der analytischen
Ultrazentrifuagtion einer 1+1-Assoziation. Vor kurzem wurde eine Selbst-
Assoziation von Usa1 und Hrd1, basierend auf ihren cytosolischen Domänen,
nachgewiesen. Vor diesem Hintergrund scheint der 2+2-Assoziationsmodus der
Realität in der Zelle näherzukommen, dies sollte jedoch durch weitere
Untersuchungen validiert werden. Die Kristallstruktur der postulierten
Hrd3-Bindedomäne von Yos9, nachfolgend DD (Dimerisierungs-Domäne) benannt,
wurde bei einer Auflösung von 2,5 Å bestimmt. Basierend auf der Dimerisierung
der DD in der Struktur wurde die Selbst-Assoziation von Yos9 untersucht. Die
Dimerisierung der Yos9-DD und des Volle-Länge-Proteins in Lösung wurde durch
analytische Ultrazentrifugation nachgewiesen. Mutagenese-Studien bestätigten
eine übereinstimmende Dimer-Anordnung im Kristall und in Lösung. Zusätzliche
biochemische Untersuchungen konnten eine Beteiligung der Yos9-DD an der
Interaktion zu Hrd3 nicht bestätigen. Stattdessen wurde die Interaktion in
vitro durch den N-terminalen Bereich von Yos9 inklusive der MRH-Domäne (aa
24-262) vermittelt. Die Struktur der Yos9-DD stellt den ersten strukturellen
Einblick in die funktionell wenig charakterisierten Domänen von Yos9 dar.
Darüber hinaus wurde hier erstmalig eine Selbst-Assoziation auf der luminalen
Seite des HRD-Komplexes beschrieben. Die Dimerisierung von Yos9 unterstützt
damit das Modell eines dimeren HRD-Komplexes.
de
dc.description.abstract
In the endoplasmic reticulum (ER), misfolded proteins are targeted for
degradation by a pathway frequently called ER-associated protein degradation
(ERAD). In yeast, the HRD complex plays a central role in this pathway. This
ubiquitin ligase complex consists of the RING-finger E3 ubiquitin ligase Hrd1
and its binding partner Hrd3, Der1, which is recruited by Usa1, and Yos9. The
recognition factor Yos9 resides on the luminal side of the complex, where it
binds to the luminal domain of the membrane anchored Hrd3. Hrd3 interacts with
ERAD substrates regardless of their glycosylation state, while Yos9 scans
bound substrates for glycan structures that indicate misfolding. This thesis
aimed at elucidating protein-protein interactions between Usa1 and Hrd1 and
between Yos9 and Hrd3, as well as gaining insights into the molecular
structure of these components. A direct interaction between the cytosolic
domains of Usa1 and Hrd1 was demonstrated in vitro using biophysical methods.
The proteins interact in a 1:1 stoichiometry with a dissociation constant in
the upper nanomolar range. Data concerning the oligomeric state of the complex
are inconsistent, with static light scattering indicating a 2+2 association
mode, while analytical ultracentrifugation indicates a 1+1 association. As
both Usa1 and Hrd1 were recently shown to self-associate based on their
cytosolic domains, the 2+2 association mode is more likely to represent the
situation within the cell, but this still has to be validated. The crystal
structure of the postulated Hrd3 binding domain of Yos9, here denoted DD
(dimerization domain), was analyzed at 2.5 Å resolution. Based on the dimeric
arrangement in this structure, the self-association of Yos9 was studied.
Analytical ultracentrifugation demonstrated the dimeric assembly of both the
DD and full-length Yos9 in solution. Mutagenesis studies confirmed that the
dimeric arrangement in the crystal structure is consistent with the
arrangement in solution. Additional biochemical assays indicated that the
Yos9-DD does not confer binding to the HRD complex, as suggested by previous
experiments. Instead, the N-terminal part of Yos9 including the MRH domain (aa
24-262) mediated the interaction in vitro. The Yos9-DD structure represents
the first structural insight into the sparsely annotated regions of Yos9.
Furthermore, this is the first time that self-association on the luminal side
of the HRD complex has been reported. Finally, the dimeric arrangement of Yos9
supports the model of a dimeric state of the HRD complex.
en
dc.format.extent
V, 107 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
endoplasmic reticulum-associated protein degradation (ERAD)
dc.subject
HRD ubiquitin-ligase complex
dc.subject
protein dimerization
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::500 Naturwissenschaften
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::548 Kristallografie
dc.title
Strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Qualitätskontrollproteinen des
Endoplasmatischen Retikulums
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Udo Heinemann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Thomas Sommer
dc.date.accepted
2011-10-27
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000034489-0
dc.title.translated
Structural and functional studies on quality control proteins of the
endoplasmic reticulum
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000034489
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000010262
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access