This thesis consists of four different parts of the synthesis and investigation of various porphyrins containing different types of linkers for the connection to substrates, conjugates of these porphyrins with hyperbranched polyglycerol (hPG) in nanoparticles and nanogels, hPG-porphyrin conjugates additionally loaded with mannose and investigation of their antibacterial activity, and cleavable porphyrin-hPG-conjugates: A) The reaction of pentafluorophenyl-substituted A3B-porphyrins with amines has been used to obtain diverse reactive groups which are useful for the further functionalization and/or conjugation to different substrates and/or materials. With this method, porphyrins with alkenyl-, alkynyl-, amino-, azido-, cyclooctyne-, epoxide-, hydroxyl- and maleimido-groups have been obtained. The conjugation of an alkynyl porphyrin to an hPG-azide via the copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloaddition (CuAAC) is shown. For a possible application in the photodynamic therapy (PDT) the photocytotoxicity of porphyrin-hPG-conjugates has been demonstrated against human epidermoid carcinoma A-253 and squamous carcinoma CAL-27 cells. To allow cleavage of the porphyrins from a carrier system, examples of porphyrins containing disulfide (for reductive cleavage) and acetal (for pH-triggered cleavage) linkers are presented. B) The multivalency effect has been investigated using hPG loaded with zinc porphyrins as photosensitizer (PS) and a systematically varied number of mannose units as targeting groups. These conjugates have been tested on their antibacterial photodynamic activity. hPG-azide with a core molecular weight (MW) of 19.5 kDa was functionalized with approx. 14 groups of the PS using the CuAAC. Subsequently, the conjugates have been further functionalized with systematically different loadings of mannose in the range of approx. 20 to 110 units. For the conjugates with approx. 58-110 mannose groups with this method the water insoluble zinc-porphyrin have been transformed to water soluble formulation. For these conjugates, the antibacterial phototoxicity against S. aureus was investigated in phosphate-buffered saline (PBS). Conjugates with approx. 69 to 110 mannose groups showed a significantly higher antibacterial activity, whereas conjugates with approx. 20 to 58 groups exhibited no activity at all. These in vitro tests showed promising results shedding light on the multivalency effect in combination with PDT. With the addition of serum, the antibacterial activity is completely quenched. We investigated this behavior with fluorescence studies performed with bovine serum albumin (BSA) suggesting protein-conjugate association as a possible cause for the loss of antibacterial activity. C) Another insight into multivalency effect came from the preparation of hPG with systematically different MW loaded with zinc porphyrins as PS and mannose groups as targeting functionality which have been tested on their antibacterial photodynamic activity. hPG-azides with a core MW between 3.7 and 100 kDa have been functionalized with approx. 4 to 108 groups of the PS [[5,10,15-tris(3-hydroxyphenyl)-20-[4-(prop-2-yn-1-ylamino)tetrafluorophenyl]porphyrinato]]-zinc(II) using the CuAAC. Additionally, polyglycerol based nanogel (nPG) with azide functionalities have been synthesized using a modified inverse nanoprecipitation. With this new method, it was possible to obtain nPGs with excess azide functionalities on the surface. The nPG-azides were further transformed to the porphyrin-nPG-conjugates via CuAAC. Subsequently, the conjugates have been further functionalized with mannose in the range of approx. 14 to 527 units. With this method the complete water insoluble zinc-porphyrin could be transformed into water-soluble formulations. Investigation of the antibacterial phototoxicity of these conjugates against S. aureus has revealed that conjugates with approx. 14 to 108 mannose groups exhibit an increasing antibacterial activity, whereas conjugates with approx. 108 to 527 groups exhibit a complete eradication of the bacteria. It has been shown that the increasing size of the porphyrin-mannose-hPG conjugates has a direct effect of antibacterial phototoxicity. With the results of the conjugates with a fixed polymer size and systematically varied mannose loadings from part B these in vitro tests show another aspect of the multivalency effect in combination with PDT. D) Porphyrin-hPG-conjugates connected via reductive and acid-cleavable linkers have been synthesized for application in PDT using CuAAC and strain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC). Employing nucleophilic aromatic substitution (SNAr), a pentafluorophenyl substituted porphyrin has been functionalized with 1,6-diaminohexane and cystamine. In the next step, these porphyrins have been further reacted with propiolic acid or bicycle[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl(4-nitrophenyl)carbonate. Porphyrin-hPG-conjugates with hPG-azide and/or hPG with acid-labile benzacetal linkers have been obtained using CuAAC or SPAAC and the previously synthesized porphyrins. With this method, the final porphyrin-hPG conjugates with acidic and/or reductive cleavable linkers were synthesized. The successful cleavage of the PS from these conjugates has been shown in different release studies. To illustrate the possible application of these conjugates selected compounds have been tested for their phototoxicity in four tumor cell lines and on the typical Gram-positive germ S. aureus.
Die vorliegende Dissertation umfasst vier separate welche zum Teil aufeinander aufbauen. Darunter fällt die Synthese und Funktionalisierung diverser Porphyrine für die zukünftige Verlinkung mit Substraten, Porphyrin-hPG Konjugate mit systematisch variierter Mannose-Beladung, Porphyrin-hPG Konjugate funktionalisiert mit Mannose mit systematisch variierter Polymergröße und Porphyrin-hPG Konjugate, in welchen die Porphyrine über spaltbare Linker mit dem Polymer verbunden sind: 1. Die Reaktion von Aminen mit Pentafluorphenyl-substituierten A3B-Porphyrinen wurde benutzt um verschiedene reaktive Gruppen für die zukünftige weitere Funktionalisierung und/oder Konjugation dieser Porphyrine an andere Substrate oder Materialien einzuführen. Porphyrine mit Alkenyl, Alkinyl, Amino, Azido, Epoxid, Hydroxyl und Maleimido-Gruppen konnten so synthetisiert werden. Zum Beispiel wurde ein Alkinyl-substituiertes Porphyrin mittels CuAAC an hPG-Azid als einem möglichen Trägersystem für die PDT konjugiert. Die Photocytotoxizität von ausgewählten Porphyrinen wie auch von den Porphyrin-hPG-Konjugaten wurde in Zell Assays mit zwei Tumorzellkulturen untersucht. Für verschiedene biomedizinische Anwendungen ist eine Freisetzung der aktiven Substanz und/oder des Fluoreszenzfarbstoffes erwünscht. Deswegen wurden zusätzlich A3B-Porphyrine synthetisiert, welche spaltbare Linker enthalten, speziell Disulfid (spaltbar unter reduktiven Bedingungen) und Acetal Linker (spaltbar unter sauren pH Bedingungen). 2. In diesem Teil der Arbeit wurde die antibakterielle photodynamische Aktivität von hPG beladen mit Zink Porphyrin als PS und Mannose Gruppen untersucht. hPG mit einer molekularen Masse MW von 19,5 kDa wurde mittels der CuAAC mit ~14 Molekülen des PS {5,10,15-Tris(3-hydroxyphenyl)-20-[4-(prop-2-yn-1-ylamino)tetrafluorphenyl]porphyrinato}Zink(II) funktionalisiert. Diese Nanopartikel Konjugate wurden weiterhin systematisch mit verschiedenen Beladungen von Mannose (zwischen ~20 und 110) Gruppen funktionalisiert. Mit höheren Mannose Beladungen (zwischen ~58 und 110 Gruppen) konnte der wasserunlösliche Zink-Porphyrin-PS in eine wasserlösliche Form überführt werden. Anschließend wurde die antibakterielle Phototoxizität der Konjugate gegen S. aureus (als typischer Gram positiver Keim) in PBS untersucht. Es zeigte sich, dass Konjugate mit ~70 bis 110 Mannose Einheiten eine signifikante antibakterielle Aktivität aufwiesen, wohingegen Konjugate mit ~20 bis 60 Einheiten nicht antibakteriell aktiv waren. Die Resultate geben einen Einblick in den Multivalenzeffekt in Kombination mit PDT. Bei Zugabe von Serum zu den Bakterienkulturen verschwand die antibakterielle Phototoxizität vollständig. Fluoreszenzstudien der Konjugate in Gegenwart von zunehmenden BSA Konzentrationen deuteten auf eine Protein-Konjugat-Assoziation als mögliche Ursache hin. 3. hPGs mit unterschiedlichen molekularen Massen bzw. Größen wurden mit Zink-Porphyrin (als PS) und Mannose Gruppen funktionalisiert. Diese Konjugate wurden anschließend auf ihre antibakterielle Phototoxizität untersucht. hPGs zwischen 3,7 und 100 kDa wurden mit ~4 bis ~108 Molekülen des PS {5,10,15-Tris(3-hydroxyphenyl)-20-[4-(prop-2-yn-1-ylamino)tetrafluorphenyl]porphyrinato}-Zink(II) mittels CuAAC funktionalisiert. Zusätzlich zu diesen Konjugaten wurde ein Polyglycerol Nanogel mit Hilfe einer neuen inversen Nanofällung hergestellt. Diese modifizierte Technik erlaubt die Synthese von nPGs mit einem Überschuss von Aziden auf der Oberfläche. Die erhaltenen nPG-Azide wurden dann weiter benutzt um die Porphyrin-nPG Konjugate mittels CuAAC zu erhalten. Diese Nanopartikel wurden anschließend weiter mit zwischen ~14 und ~527 Mannose Einheiten (als Targeting Gruppen) funktionalisiert. Auch mit dieser Methode konnte der wasserunlösliche Zink-Porphyrin-PS bei allen Konjugaten in eine wasserlösliche Formulierung überführt werden. Die antibakterielle Phototoxizität der Konjugate gegen Kulturen von S. aureus wurde in PBS untersucht. Es zeigte sich, dass Konjugate zwischen ~14 und ~108 Mannose Einheiten eine zunehmende antibakterielle Aktivität aufwiesen. Die Konjugate mit ~108 und ~527 Gruppen zeigten eine vollständige Auslöschung der Bakterien. Diese Resultate weisen einen weiteren Aspekt des Multivalenzeffektes hin: Der Einfluss unterschiedlicher molekularer Massen der Konjugaten in Kombination mit der PDT. 4. Dieser letzte Teil der Arbeit befasst sich mit hPG-Porphyrin-Konjugaten mit spaltbaren Linkern. Dafür wurde ein Syntheseweg für solche Porphyrin-hPG Konjugate mittels CuAAC und SPAAC entwickelt. Im ersten Schritt erfolgte eine Funktionalisierung von 10,15,20-Tris(3-hydroxyphenyl)-5-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)porphyrin durch nukleophile aromatische Substitution mit 1,6-Diaminohexan bzw. Cystamin funktionalisiert. Die erhaltenen Porphyrine wurden weiter mit Propiolsäure oder Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyl(4-nitrophenyl)karbonat umgesetzt. Parallel wurden Azid-funktionalisierte hPGs und hPGs mit säurelabilen Benzacetal Linkern synthetisiert und mit den Porphyrinen und Mannose mittels CuAAC und SPAAC verknüpft. Auf diese Weise konnten Porphyrin-hPG Konjugate mit sauer und/oder reduktiv spaltbaren Linkern erhalten werden. Die Abspaltung des PS vom Carrier konnte in verschiedenen Freisetzungsstudien gezeigt werden. Um eine mögliche Anwendung für die PDT zu prüfen, wurde die Phototoxität von ausgewählten Konjugaten an verschiedenen Tumorzelllinien und Kulturen von S. aureus getestet. Hierbei erwiesen sich einige der Konjugate als gut wirksam gegen S. aureus, insbesondere eines der Konjugate mit einer Kombination aus sauer und reduktiv spaltbarem Linker.
