dc.contributor.author
Erdogan, Fikret
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:14:15Z
dc.date.available
2003-04-23T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2233
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-6434
dc.description
Titelblatt
Widmung
I. Inhaltsverzeichnis I
II. Abkürzungen VI
1\. Einleitung 1
2\. Materialien 19
3\. Methoden 38
4\. Ergebnisse 73
5\. Diskussion 103
6\. Zusammenfassung 121
7\. Summary 122
8\. Literatur 123
9\. Anhang 139
9.1 Danksagung 139
9.2 Publikationen 140
9.3 Lebenslauf 141
dc.description.abstract
In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zur Detektion von SNPs mit Hilfe von
Oligonukleotid-Mikroarraysbeschrieben. Diese Methode stützt sich auf die
Allel-spezifische Elongation von immobilisierten Oligonukleotiden,bei der ein
Fluoreszenz-markiertes Nukleotid (Cy3-dUTP) eingebaut und mittels konfokalem
Laser Scanner detektiert wird. Um den Ertrag an verlängertem Produkt zu
steigern, wurden mehrere Zyklen bestehend aus einem Denaturierungs-,
Annealing- und Elongationsschritt durchgeführt. Humane mitochondriale DNS
wurde als Modellsystem verwendet und in der Reaktion verwendete Einzelstrang
DNS Sonden wurden auf zwei verschiedenen Wegen hergestellt. Hierbei handelte
es sich um asymmetrische PCR Produkte und Exonuklease-behandelte PTO-
modifizierte PCR Produkte. Beide Sonden erwiesen sich als brauchbar für den
Einsatz im SNP Detektions System. Es wurde zeigt, dass mit einem
asymmetrischen 426 bp PCR Produkt neun SNPs parallel detektiert werden können.
Zur Herstellung des asymmetrischen Produktes reichte der Einsatz eines
einzigen Oligonukleotides in der PCR Reaktion aus. Als Matrize diente ein 426
bp PCR Produkt. 46 von 48 SNPs konnten durch den Einsatz von 3 asymmetrischen
multiplex PCR Produkten nachgewiesen werden. Der Nachteil von asymmetrischen
PCR Reaktionen ist die schwierige Beurteilung von multiplex Reaktionen, weil
die asymmetrischen PCR Produkte als ein Schmier von Banden im Agarosegel
erscheinen. Die Verwendung von Exonuklease-behandelten PTO-modifizierte PCR
Produkten als Sonde ist deshalb vorteilhaft. Mit dem Einsatz 5 solcher
Produkte einer Länge von 2,5 bis 4,4 kb konnten 44 von 46 zufällig verteilten
mitochondrialen SNPs typisiert werden. Diese 5 DNS-Sonden decken zusammen das
mitochondriale Genom vollständig ab. Es konnte ermittelt werden, dass
Einzelstrang-Sonden dieser Art bis zu einer Grösse zwischen 4,4kb und 5,7kb in
der Primer-Elongations-Reaktion eingesetzt werden können. Das hier
beschriebene Verfahren vereinfacht ausserdem die PCR Amplifikation von SNP
Loci, welche einen entscheidenden Engpaß bei Microarray-basierten SNP-
Typisierungs Methoden in hohem Durchsatz dargestellt.
de
dc.description.abstract
In this study we describe a novel protocol for the detection of SNPs using
oligonucleotide microarrays. The method relies on the allele-specific
elongation of immobilized oligonucleotide primers during which a fluorescently
labeled nucleotide (Cy3-dUTP) is incorporated and detected by confocal laser
scanning. Cycled reactions consisting of a denaturation, annealing and
elongation step are employed to increase the yield of elongated product. Using
human mitochondrial DNA as a model system, we tested two different means of
generating single-stranded DNA targets used in the reactions: asymmetric PCR
products and exonuclease-treated PTO-modified PCR products. Both proved to be
suitable in this SNP detection system. Using asymmetric PCR products, we
demonstrated that a single PCR primer upstream of 9 SNPs in a 426 bp template
is sufficient. 46 of 48 SNPs could be detected in this way using 3 multiplexed
asymmetric PCR reactions. The disadvantage of asymmetric PCR reactions is the
difficult judgement of multiplexed reactions since asymmetric PCR products
appear as a smear of bands in agarose gels. The application of exonuclease-
treated PTO-modified PCR products as targets is therefore advantageous. More
importantly, however, we demonstrate that it is possible to type 44 out of 46
randomly distributed mitochondrial SNPs by using 5 targets of 2.5kb to 4.4kb
which together cover the entire mitochondrial genome. The size limit of such
targets was found to lie between 4.4kb and 5.7kb. The approach described here
simplifies PCR-amplification of SNP loci, which is a major problem in
transforming microarray-based SNP typing into a high-throughput method.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
single nucleotide polymorphism, SNP, genotyping, mutation detection, microarrays,DNA analysis
dc.subject
Primer extension
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Typisierung biallelischer Marker (SNPs) mit DNS-Mikrorastern
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Hans-Hilger Ropers
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Volker A. Erdmann
dc.date.accepted
2003-03-05
dc.date.embargoEnd
2003-04-29
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2003000996
dc.title.translated
Typing of bi-allelic marker (SNPs) with DNA microarrays
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000000951
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2003/99/
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FUDISS_derivate_000000000951
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free
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open access