In dieser Arbeit wurde eine neue Methode zur Detektion von SNPs mit Hilfe von Oligonukleotid-Mikroarraysbeschrieben. Diese Methode stützt sich auf die Allel-spezifische Elongation von immobilisierten Oligonukleotiden,bei der ein Fluoreszenz-markiertes Nukleotid (Cy3-dUTP) eingebaut und mittels konfokalem Laser Scanner detektiert wird. Um den Ertrag an verlängertem Produkt zu steigern, wurden mehrere Zyklen bestehend aus einem Denaturierungs-, Annealing- und Elongationsschritt durchgeführt. Humane mitochondriale DNS wurde als Modellsystem verwendet und in der Reaktion verwendete Einzelstrang DNS Sonden wurden auf zwei verschiedenen Wegen hergestellt. Hierbei handelte es sich um asymmetrische PCR Produkte und Exonuklease-behandelte PTO- modifizierte PCR Produkte. Beide Sonden erwiesen sich als brauchbar für den Einsatz im SNP Detektions System. Es wurde zeigt, dass mit einem asymmetrischen 426 bp PCR Produkt neun SNPs parallel detektiert werden können. Zur Herstellung des asymmetrischen Produktes reichte der Einsatz eines einzigen Oligonukleotides in der PCR Reaktion aus. Als Matrize diente ein 426 bp PCR Produkt. 46 von 48 SNPs konnten durch den Einsatz von 3 asymmetrischen multiplex PCR Produkten nachgewiesen werden. Der Nachteil von asymmetrischen PCR Reaktionen ist die schwierige Beurteilung von multiplex Reaktionen, weil die asymmetrischen PCR Produkte als ein Schmier von Banden im Agarosegel erscheinen. Die Verwendung von Exonuklease-behandelten PTO-modifizierte PCR Produkten als Sonde ist deshalb vorteilhaft. Mit dem Einsatz 5 solcher Produkte einer Länge von 2,5 bis 4,4 kb konnten 44 von 46 zufällig verteilten mitochondrialen SNPs typisiert werden. Diese 5 DNS-Sonden decken zusammen das mitochondriale Genom vollständig ab. Es konnte ermittelt werden, dass Einzelstrang-Sonden dieser Art bis zu einer Grösse zwischen 4,4kb und 5,7kb in der Primer-Elongations-Reaktion eingesetzt werden können. Das hier beschriebene Verfahren vereinfacht ausserdem die PCR Amplifikation von SNP Loci, welche einen entscheidenden Engpaß bei Microarray-basierten SNP- Typisierungs Methoden in hohem Durchsatz dargestellt.
In this study we describe a novel protocol for the detection of SNPs using oligonucleotide microarrays. The method relies on the allele-specific elongation of immobilized oligonucleotide primers during which a fluorescently labeled nucleotide (Cy3-dUTP) is incorporated and detected by confocal laser scanning. Cycled reactions consisting of a denaturation, annealing and elongation step are employed to increase the yield of elongated product. Using human mitochondrial DNA as a model system, we tested two different means of generating single-stranded DNA targets used in the reactions: asymmetric PCR products and exonuclease-treated PTO-modified PCR products. Both proved to be suitable in this SNP detection system. Using asymmetric PCR products, we demonstrated that a single PCR primer upstream of 9 SNPs in a 426 bp template is sufficient. 46 of 48 SNPs could be detected in this way using 3 multiplexed asymmetric PCR reactions. The disadvantage of asymmetric PCR reactions is the difficult judgement of multiplexed reactions since asymmetric PCR products appear as a smear of bands in agarose gels. The application of exonuclease- treated PTO-modified PCR products as targets is therefore advantageous. More importantly, however, we demonstrate that it is possible to type 44 out of 46 randomly distributed mitochondrial SNPs by using 5 targets of 2.5kb to 4.4kb which together cover the entire mitochondrial genome. The size limit of such targets was found to lie between 4.4kb and 5.7kb. The approach described here simplifies PCR-amplification of SNP loci, which is a major problem in transforming microarray-based SNP typing into a high-throughput method.
