Bone forming cells of mesenchymal origin and hematopoietic cells of the immune system interact in the bone marrow. Both cell types show high plasticity under homeostatic conditions as well as during bone healing after an injury. Bone marrow is also the central organ for hematopoiesis and harbors the immunological memory. Above all, regeneration and formation of an immunological memory are processes that take place over a period of weeks to months. Since the underlying mechanisms are controlled on the cellular level, in vivo multiphoton fluorescence microscopy is the most appropriate and common method to gain insight into the dynamics of these interactions in living tissue under physiological and pathological conditions. However, already established methods for intravital microscopy in the bone marrow of mice are, either designed for imaging a few hours and thus not for repeated, i.e. longitudinal observations, or not designed for long bones, but only for flat bones, i.e. calvarium. In addition, they are physically limited to penetration depths of approx. 100 - 150 µm below the bone cortex. In the present work, in order to fulfil the needs in understanding bone biology a new microendoscopic technique based on gradient index (GRIN) lenses was developed and applied to analyze cellular dynamics in vivo. An internal fixation system ensured the precise positioning of a GRIN endoscope in the femoral bone marrow tissue over months. The optical performance of the endoscope system was comparable to other methods for intravital microscopy in the bone marrow. Via a chronic window, which can be introduced into the bone marrow cavity both centrally and pericortically, we were able for the first time to observe and quantify changes in the vascular structure in one and the same individual over month. The observed plasticity of the blood vessels seems to be unique compared to other tissues. Using histological and flow cytometric methods, we could exclude the possibility that this is a process driven by regeneration processes caused by implantation procedure. Additionally, to account for the complex dynamic interactions between various cellular and extra-cellular compartments, a method for non-linear asymmetric two-photon excitation (ATPE) and digital unmixing of the recorded fluorescence signals was established, which can be used for the multiplexed recording of eight different tissue components. The novel endoscope system enables longitudinal intravital microscopy in the murine bone marrow (LIMB) to analyze the osteoimmune system in vivo under homeostatic and pathological conditions. With LIMB we expect to gain a deeper insight into the role of the immune system in bone healing, as well as into the establishment and maintenance of immunological memory cells, such as long-lived plasma cells in their special survival niches.
Knochenbildende Zellen mesenchymalen Ursprungs und hämatopoetische Zellen des Immunsystems interagieren im Knochenmark. Sie besitzen sowohl unter homöostatischen Bedingungen als auch während der Knochenheilung nach einer Fraktur eine hohe Plastizität. Das Knochenmark ist das zentrale Organ für die Hämatopoese und unser immunologisches Gedächtnis. Knochenregeneration und die Bildung des immunologischen Gedächtnisses sind Vorgänge, die innerhalb von Wochen oder Monaten ablaufen. Da die zugrundeliegenden Mechanismen auf zellulärer Ebene kontrolliert werden, ist die in vivo Multiphotonen-Mikroskopie die geeignetste Methode, um einen Einblick in die dynamischen Interaktionen im lebenden Gewebe unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu gewinnen. Die bereits etablierten Methoden zur Intravitalmikroskopie im Knochenmark von Mäusen sind jedoch zum einen entweder auf Aufnahmen über wenige Stunden und nicht für wiederholte, d.h. longitudinale Beobachtungen ausgelegt, sowie physikalisch auf Eindringtiefen von ca. 100 - 150 µm beschränkt, oder lassen sich nicht auf Röhrenknochen anwenden. Um den Anforderungen der Analyse der Knochenbiologie entgegenzutreten, wurde eine neue mikro-endoskopische Technik, die auf Gradienten-Index-Linsen (GRIN-Linsen) basiert, entwickelt und getestet. Dabei wurde ein interner Fixateur verwendet, welcher über Monate die präzise Positionierung eines GRIN-Endoskops im Knochenmarksgewebe des Femurs von Mäusen gewährleistet. Die optische Leistungsfähigkeit des Endoskops war mit anderen Methoden zur Intravitalmikroskopie im Knochenmark vergleichbar. Mit Hilfe des Endoskops, welches sowohl zentral als auch perikortikal ins Knochenmark eingebracht werden kann, waren wir erstmals in der Lage Veränderungen in der Gefäßstruktur in ein und demselben Individuum über Monate zu verfolgen und zu quantifizieren. Es zeigte sich eine hohe Plastizität der Blutgefäße, welche im Vergleich zu anderen Geweben einzigartig zu sein scheint. Wir konnten dabei mittels histologischer und durchflusszytometrischer Methoden ausschließen, dass es sich um einen durch Regenerationsprozesse getriebenen Vorgang handelt, der als Reaktion auf die Implantation des Systems ausgelöst wurde. Um die komplexen, dynamischen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen zellulären und extrazellulären Kompartimenten in der intravitalen Bildgebung zu berücksichtigen, wurde des Weiteren ein Verfahren zur nichtlinearen asymmetrischen Zwei-Photonen-Anregung (ATPE) und der digitalen Entfaltung der aufgenommenen Fluoreszenzsignale etabliert, welches zur parallelen Aufnahme von acht verschiedenen Gewebekompartimenten genutzt werden kann. Damit ermöglicht das neuartige Endoskopsystem die longitudinale Intravitalmikroskopie im murinen Knochenmark (LIMB) zur Analyse des Osteo-Immunsystems in vivo unter homöostatischen und pathologischen Bedingungen. Mit LIMB erhoffen wir uns einen tieferen Einblick in die Rolle des Immunsystems im Verlauf der Knochenheilung, sowie in die Etablierung und des Erhalts immunologischer Gedächtniszellen, wie z.B. langlebiger Plasmazellen in den speziellen Überlebensnischen, zu gewinnen.
