Generation and application of genomic tools as important prerequisites for sugar beet genome analyses

Abstract

Genetic and physical maps of a genome are essential tools for structural, functional and applied genomics. Genetic maps allow the detection of quantitative trait loci (QTLs), the characterisation of QTL effects and facilitate marker-assisted selection (MAS). The characterisation of genome structure and analysis of evolution is augmented by physical maps. Whole genome physical maps or ultimately complete genomic sequences, respectively, of a species display frameworks that provide essential information for understanding processes in respect to physiology, morphology, development and genetics. However, comprehensive annotation underpins the values a genome sequence or physical map represents. An important task of genome annotation is the linkage of genetic traits to the genome sequence, which is facilitated by integrated genetic and physical maps. In the context of this study several sugar beet (Beta vulgaris L.) genomic tools were developed and applied for evolutionary studies and linkage analysis. A new technique allowing high- throughput identification and genotyping of genetic markers was developed, utilising representational oligonucleotide microarray analysis (ROMA). We tested the performance of the method in sugar beet as a model for crop plants with little sequence information available. Genomic representations of both parents of a mapping population were hybridised on microarrays containing custom oligonucleotides based on sugar beet bacterial artificial chromosome (BAC) end sequences (BESs) and expressed sequence tags (ESTs). Subsequent analysis identified potential polymorphic oligonucleotides, which were placed on new microarrays used for screening of 184 F2 individuals. Exploiting known co-dominant anchor markers, we obtained 511 new dominant markers distributed over all nine sugar beet linkage groups and calculated genetic maps. Besides the method´s transferability to other species, the obtained genetic markers will be an asset for ordering of sequence contigs in the context of the ongoing sugar beet genome sequencing project. In addition, possible linkage of physical and genetic maps was provided, since genetic markers were based on source sequences, which were also used for construction of a BAC based physical map utilising a hybridisation approach. An example of the hybridisation based approach for physical map construction and its application for synteny studies was demonstrated. Since little is known about synteny between rosids and Caryophyllales so far, we analysed the extent of synteny between the genomic sequences of two BAC clones derived from two different Beta vulgaris haplotypes and rosid genomes. For selection of the two BAC clones we hybridised 30 oligonucleotide probes based on ESTs corresponding to Arabidopsis orthologs on chromosomes 1 and 4 that were presumably co-localised in the reconstructed Arabidopsis pseudo ancestral genome (Blanc et al. 2003) on sugar beet BAC macroarrays comprising two different sugar beet libraries. A total of 27,648 clones were screened per sugar beet library, corresponding to 4.4-fold and 5.5-fold, respectively, sugar beet genome coverage. We obtained four and five positive clones for the probes on average. Two clones, one from each haplotype that were positive with the same five EST probes, were selected and their genomic sequences were determined, annotated and exploited for synteny studies. Furthermore, I constructed and characterised a sugar beet fosmid library from the doubled haploid accession KWS2320 encompassing 115,200 independent clones. The insert size of the fosmid library was determined by pulsed field gel electrophoresis to be 39 kbp on average, thus representing 5.9-fold coverage of the sugar beet genome. Fosmids bear the advantage of narrowly defined size of the clone inserts, thus fosmid end sequences will essentially contribute to the future assembly and ordering of sequence contigs. Since repeats are a major obstacle for successful assembly of plant genome sequences, frequently causing gaps and misassembled contigs, I generated a genomic short-insert library. The short-insert library facilitated repeat identification within the sugar beet genome, which was exemplarily shown for three miniature inverted-repeat transposable element (MITE) families. Altogether this work contributed substantially to a deeper understanding of the genome structure of sugar beet and provided the basis for successful sequencing of the sugar beet genome.

Genetische und physikalische Karten eines Genoms sind essentielle Werkzeuge für strukturelle, funktionelle und angewandte Genomik. Genetische Karten erlauben die Identifizierung von „Quantitative Trait Loci“ (QTLs), die Charakterisierung von QTL-Effekten, und sie ermöglichen Marker gestützte Selektion in der Züchtung. Die Charakterisierung der Genomstruktur, sowie Evolutionsanalysen werden durch physikalische Karten ermöglicht. Umfassende physikalische Karten, bzw. letztendlich eine vollständige Sequenz des Genoms einer Spezies, stellen Gerüste dar, die essentielle Informationen zum Verständnisvon Prozessen die Physiologie, Morphologie, Entwicklung und Genetik betreffend, enthalten. Der Nutzen einer physikalischen Karte bzw. einer Genomsequenz hängt jedoch von einer guten, umfangreichen Annotation ab. Ein wichtiger Bestandteil der Genomannotation ist die Verknüpfung von genetischen Merkmalen mit der Genomsequenz, die durch die Integration von genetischen und physikalischen Karten erreicht wird. Im Kontext dieser Arbeit wurden verschiedene Werkzeuge für Genomik-Studien in der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) entwickelt und angewandt, um Evolutionsstudien und Kopplungsanalysen durchzuführen. Es wurde eine neue Technik entwickelt, die basierend auf „Representational Oligonucleotide Microarray Analysis” (ROMA), Hochdurchsatz- Identifikation und -Genotypisierung von genetischen Markern ermöglicht. Die Methode wurde in der Zuckerrübe als Model für Kulturpflanzen mit wenig verfügbarer Sequenzinformation getestet. Hierzu wurden genomische Repräsentationen beider Elternlinien einer Kartierungspopulation auf Microarrays mit benutzerdefinierten Oligonukleotiden, basierend auf Zuckerrüben „Bacterial Artificial Chromosome” (BAC) -Endsequenzen (BESs) und „Expressed Sequence Tags“ (ESTs), hybridisiert. Folgende Analysen führten zur Identifizierung von potentiell polymorphen Oligonukleotiden. Diese wurden zum Design weiterer Microarrays verwendet, die zum Screening von 184 F2-Individuen dienten. Unter Zuhilfenahme bekannter kodominanter Marker konnten 511 neue, über alle neun Kopplungsgruppen der Zuckerrübe verteilte, dominante Marker gewonnen und genetische Karten berechnet werden. Zusätzlich zu der Möglichkeit die Technik auch auf andere Spezies anzuwenden, stellen die neu gewonnenen genetischen Marker ebenfalls einen Zugewinn für die Anordnung von Sequenz- Contigs im Rahmen des zurzeit laufenden Zuckerrübengenom- Sequenzierungsprojekts dar. Zudem wurde eine Verknüpfung der genetischen Karte mit der physikalischen Karte ermöglicht, da die Sequenzen auf denen die genetischen Marker beruhen ebenfalls für die Konstruktion einer BAC basierten physikalischen Karte genutzt wurden. Ein Bespiel des Hybridisierungs-Ansatzes, der zur Generierung der physikalischen Karte genutzt wurde, und seine mögliche Anwendung für Syntänie- Studien wurde im Weiteren demonstriert. Da bisher wenig bekannt ist über Syntänie zwischen Rosiden und Caryophyllales, untersuchten wir den Syntäniegrad zwischen den genomischen Sequenzen zweier BAC-Klone, gewonnen aus zwei verschiedenen Zuckerrüben- Haplotypen und Rosiden-Genomen. Für die Auswahl der zwei BAC-Klone hybridisierten wir 30 Oligonukleotid-Sonden auf Zuckerrüben BAC-Makroarrays, die zwei verschiedene Zuckerrüben-Banken umfassten. Die Sonden basierten auf ESTs, welche Arabidopsis Orthologen auf den Chromosomen 1 und 4 entsprachen, die ursprünglich im rekonstruierten pseudo-anzestralen Arabidopsis-Genom kolokalisiert waren (Blanc et al. 2003). Insgesamt wurden 27.648 Klone pro Zuckerrüben Bank untersucht. Dies entspricht einer 4,4-fachen bzw. 5,5-fachen Abdeckung des Zuckerrübengenoms. Im Durchschnitt erhielten wir vier bzw. fünf positive Klone pro Sonde. Zwei Klone jedes Haplotyps, die positiv für die gleichen EST-Sonden waren, wurden ausgewählt und ihre genomischen Sequenzen wurden ermittelt, annotiert und für Syntänie-Studien verwendet. Desweiteren konstruierte und charakterisierte ich eine Zuckerrüben-Fosmidbank mit 115.200 vereinzelten Klonen aus der doppelt-haploiden Linie KWS2320. Die Größe der Fosmid-Inserts wurde mittels Pulsfeldgelelektrophorese bestimmt und betrug 39 kbp im Durchschnitt, d.h. die Fosmidbank deckte das Zuckerrübengenom 5,9-fach ab. Fosmide weisen den Vorteil auf, dass ihre Insertgröße kaum variiert und daher Fosmid- Endsequenzen die zukünftige Assemblierung und Orientierung von Sequenz-Contigs ebenfalls entscheidend unterstützen werden. Da repetitive Elemente ein großes Hindernis für die erfolgreiche Assemblierung von Pflanzengenomsequenzen sind und häufig große Lücken in Genomsequenzen oder falsch assemblierte Contigs verursachen, habe ich zusätzlich eine genomische „Shotgun“-Klonbank mit kleinen Insert hergestellt. Diese ermöglichte die Identifikation von repetitiven Elementen im Zuckerrübengenom, wie es beispielhaft für drei „Miniature Inverted-Repeat Transposable Element” (MITE) Familien gezeigt wurde. Insgesamt trug diese Arbeit erheblich zu einem tieferen Verständnis der Struktur des Zuckerrübengenoms bei und stellte die Basis für die erfolgreiche zukünftige Sequenzierung des Zuckerrübengenoms dar.