Pain signaling is highly complex and involves a number of cellular and molecular processes that lead to initiation and maintenance of different types of pain. Elucidation of these mechanisms is key to the development of treatments that specifically target underlying causes. Though it is widely known that the detection of painful stimuli in the periphery strongly relies on the activation of the voltage-gated sodium channels (VGSCs) Nav1.8, it has been difficult to assign the function of individual VGSC subtypes. Nine VGSCs are expressed in mammals displaying diverse physiological functions, and gene deletion studies of single subunits lead to functional alterations in other VGSCs whereas antisense treatment is not long-lasting and therefore lacks clinical relevance. Other approaches using naturally occurring peptide toxins derived from venomous animals have been successfully used to study the function of individual ion channels but lack the cell autonomy. Thus, novel therapeutical tools need to be developed. This thesis demonstrates that permanent and cell-autonomous inactivation of only Nav1.8 channels is possible by transgenic expression of a membrane-tethered conotoxin MrVIa (t-MrVIa). Based on the genetic elements of the Nav1.8 BAC, t-MrVIa expression was exclusively found in nociceptive neurons, whereas adjacent mechanoreceptors were not affected. This expression resulted in a reduction of Nav1.8-mediated currents in t-MrVIa transgenic mice which could be reversed by enzymatic cleavage using PI-PLC, thus providing an additional level of regulation. In contrast to gene deletion studies this block did not result in transcriptional or functional upregulation of other VGSCs. Furthermore, t-MrVIa expression did not alter the cell number of peripheral neurons, the central targeting pattern or the chemical redistribution of nociceptor population. This therefore provides a “clean” genetic method of addressing individual ion channels in vivo. Behaviorally, t-MrVIa mice show decreased inflammatory hyperalgesia and insensitivity to noxious cold, accompanied by a reduced firing rate of cutaneous C-fibers at noxious cold temperatures. This study demonstrates that inactivation of Nav1.8 alone is critical for the perception of pain. Thus genetically encoded tethered toxins can be used to unambiguously assign cellular functions to individual ionic currents in the mammalian nervous system.
Die molekularen Mechanismen, die der Schmerzwahrnehmung und -weiterleitung zu Grunde liegen sind äußerst komplex. Die Aufklärung solcher Mechanismen ist von fundamentaler Bedeutung, um die Funktionsweise von Molekülen und Ionenkanälen aufzudecken, um spezielle Arten von Schmerzen klinisch gezielt behandeln zu können. Obwohl es weithin bekannt ist, dass Schmerzreize im peripheren Nervensystem zum großen Teil von dem spannungsabhängigen Ionenkanal Nav1.8 detektiert werden, hat es sich bisher als schwierig herausgestellt die Funktion von einzelnen spannungsabhängigen Natriumkanälen zu analysieren. Neun spannungsabhängigen Natriumkanälen mit unterschiedlichen physiologischen Funktionen werden in Säugern exprimiert. Allerdings haben konventionelle null- Mutationen von Nav1.8 zur kompensatorischen Desregulierung von verwandten spannungsabhängigen Natriumkanälen geführt, während antisense-Versuche keine langanhaltende Runterregulierung zeigte. Andere Studien verwendeten natürlich vorkommende Neurotoxine, welche spezifisch mit Nav1.8 agierten, jedoch nicht zellautonom wirkten. Daher ist es notwendig neue therapeutische Methoden zu entwickeln, welche die Analyse von gezielt einem Ionenkanal ermöglichen. Diese Doktorarbeit zeigt zum ersten Mal, dass die Expression eines membrangebundenen Toxins MrVIa (t-MrVIa) in Mäusen eine permanente und zellautonome Inaktivierung von Nav1.8 ermöglicht. Anhand der genetischen Elemente von dem verwendeten Nav1.8 BAC wurde die t-MrVIa Expression gezielt auf die Nozizeptoren gelenkt, während benachbarte Mechanorezeptoren das Toxin nicht expremierten. Diese Expression führte zu einer Reduzierung des Nav1.8 Stroms in t-MrVIa Mäusen, welche mittels Spaltung mit dem Enzym PI-PLC rückgängig gemacht werden konnte und so eine zusätzliche Art der Regulierung darstellt. Im Gegensatz zur Nullmutation von Nav1.8 erfolgte keine Desregulierung anderer spannungsabhängiger Natriumkanäle auf RNA Ebene und keine funktionellen Änderungen des Natriumstroms in t-MrVIa Mäusen. Weiterhin änderte die t-MrVIa Expression weder die Anzahl peripherer Neurone, noch die zentrale Innervation ins Rückenmark oder die neurochemische Zusammensetzung nozizeptorischer Subpopulationen. T-MrVIa Mäuse zeigten eine Reduzierung der inflammatorischen Hyperalgesie und waren nicht sensitiv zu noxischer Kälte, was auch durch eine geringeres Auftreten von Aktionspotentialen belegt werden konnte. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Inaktivierung von Nav1.8 allein entscheidend ist für die Schmerzwahrnehmung. Daher stellen genetisch exprimierte membrangebundene Toxine eine einmalige Möglichkeit dar, um die zellulär Funktion von einem Ionenkanal im Nervensystem aufzuklären.
