Zusammenfassung Die Verabreichung von nackten Wirkstoffen ist mit zahlreichen intra- und extrazellulären Barrieren verbunden, die auf die pharmakokinetischen Eigenschaften des jeweiligen Wirkstoffes, wie beispielsweise Doxorubicin oder siRNA zurückzuführen sind. Um diese Hürden zu überwinden sind Wirkstoffträgersysteme notwendig, die in der Lage sind diese Wirkstoffe sicher zu verkapseln und auf ihrem Weg von der Verabreichung bis zum Wirkort zu schützen und schließlich freizusetzen. Durch diesen Transport kann z.B. nackte siRNA geschützt bis in Zytosol transportiert und freigesetzt werden. Die siRNA ist Auslöser für einen hochspezifischen RNA-Interferenz Mechanismus, der in seiner Folge Gene stillegt. Als Transporter für die siRNA eignen sich insbesondere dendritische Polyamine, da sie aufgrund ihrer multiplen Amingruppen mit dem negativ geladenen Rückgrat von Nukleinsäuren wie DNA / siRNA wechselwirken können, einen Komplex bilden, die Zellaufnahme ermöglichen, und die endosomale Freisetzung unterstützen. Auch deren strukturelle Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle für eine effiziente Transfektion. In Vorarbeiten wurde bereits ein dendritischen Polyglycerin (dPG) basierendes hochfunktionalisiertes Polyamin (dPG-NH2 mit einem Aminierungsgrad von 90% und MW ~ 10 kDa) für die siRNA Transfektion in vitro und in vivo entwickelt. Allerdings ist das therapeutische Fenster dieses Vektors zu klein, sodass die in vivo Anwendung limitiert war. Deswegen lag der Hauptfokus dieser Doktorarbeit die multiplen strukturellen Eigenschaften des Wirkstoffträgers dPG zu variieren, um eine sicherere und effizientere siRNA Verabreichung zu gewährleisten. Zu den durchgeführten Modifikationen zählen unter anderem die Entwicklung von Polymaminen mit unterschiedlichem Funktionalisierungsgrad, die Variation der Art der eingeführten Aminfunktionalität, sowie die Größe des dPG Kerns. Für eine Struktur- Aktivitätsstudie wurden zunächst dPG-NH2 Analoga mit variierendem Aminierungsgrad (mit dPG MW ~10 kDa) hergestellt und mit Hinblick auf siRNA Komplexierung, Zytotoxizität, sowie Knockdown Effizienz in vitro und in vivo ausgewertet. Hierbei hat sich gezeigt, dass bestimmte Aminierungsgrade (z.B. 50% für 10 kDa dPG) für eine effiziente siRNA Transfektion notwendig sind. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch eine Studie an einem theoretischen Modell, welche stärkere Wechselwirkung zwischen einem 21-Basenpaar DNA Modell und einem dPG-NH2 Analoga mit einem Aminierungsgrad von 50% und höher vorausgesagt hat. Für den zweiten Teil dieser Arbeit wurden dPG-Amine mit hohem Molekulargewicht (dPG Mn ~43 kDa) und mit verschiedenen Funktionalisierungsgraden hergestellt, um das Sicherheitsprofil von dPG-NH2 in vivo zu untersuchen. Die Ergebnisse der in vivo Studie mit dPG-NH2 50% (dPG Mn ~43 kDa) zeigten eine niedrigere induzierte Immunantwort sowie eine höhere Effizienz des Luciferase Knockdowns, verglichen mit den Analoga niedrigeren Molekulargewichts (dPG MW ~10 kDa). Dabei wurde ein effektiver siRNA Vektor mit einer optimalen Ladungsdichte erhalten, dessen positive Ladung hoch genug ist, um die zelluläre Aufnahme sowie die stabile Komplexbildung mit siRNA bei niedrigen N/P Verhältnissen zu gewährleisten, jedoch niedrig genug ist, um keine Immunantwort zu induzieren. Des weiteren wurden Arginin und Histidin an die primären Amine der äußeren Sphäre von dPG (MW ~10 kDa) gebunden, um die Zytotoxizität von dPG-NH2 bei gleichbleibender Effektivität der siRNA Transfektion zu minimieren. Das Ergebnis war ein optimaler siRNA Vektor, der analog zum Lipofectamine® eine vergleichbare Transfektionseffizienz bei gleichzeitiger minimaler Zytotoxizität aufwies. Interessanterweise verbesserte die Einführung der Aminosäuren sowohl die in vitro Transfektion als auch die Zytotoxizität von dPG-NH2. Schließlich wurden bispezifische Antikörper mit dualer Spezifität ausgewählt, um mit dem Hapten Digoxigenin funktionalisierte Polyglycerol-basierte Prodrugs in LeY Antiköper exprimierende MCF-7 Zellen zu transportieren. In dieser Studie konnte die gezielte Bindung und Aufnahme des dPG Prodrugs nachgewiesen werden. Es konnte jedoch keine Target-spezifische Toxizität bei Digoxigenin funktionalisierten dPG Prodrugs beobachtet werden. Dies könnte an der nichtspezifischen Wechselwirkung und Aufnahme der Pro- Pharmaka liegen, die mit deren aktiver Aufnahme konkurriert. Die in dieser Arbeit präsentierten Studien zeigen allesamt, dass das zielgerichtete und maßgeschneiderte Design der dPG-basierten Transportsysteme im Hinblick auf deren finale Anwendung von zentraler Bedeutung sind. Beispielsweise wird ein Funktionalisierungsgrad von > 50% des dPGs mit Amin benötigt um eine effiziente siRNA Transfektion in vitro und in vivo zu erreichen. Außerdem weist dPG-NH2 mit einem Molekulargewicht von 45 kDa und einem Funktionalisierungsgrad von 50 % in vivo eine erhöhte siRNA Transfektion und ein besseres Toxizitätsprofil, verglichen mit seinem Analogon mit niedrigem Molekulargewicht auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl die Fähigkeit der Amingruppen als Komplexbildner für die siRNA zu fungieren, als auch die Anwesenheit von Gruppen, die die endosomale Freisetzung begünstigen ausschlaggebend für eine effiziente und sichere siRNA Transfektion sind. Als Ausblick kann die Strategie des aktiven Targetings, wie z.B. bei der Anwendung von bispezifischen Antikörpern, adaptiert werden um eine gewebespezifische siRNA Transfektion zu bewirken.
Abstract Drug delivery systems are necessary to overcome multiple extracellular and intracellular barriers that are ahead of conventional low molecular weight and macromolecular drugs like siRNA. Cytosolic delivery of the siRNA results in highly specific silencing of diseases-associated mRNAs and thereby addressing many diseases at the molecular level. Dendritic polyamines possess multiple favorable characteristics for nucleic acid delivery including facile complex formation with a negatively charged backbone of DNA/siRNA through multiple amine functionalities, mediation in cellular uptake, and endosomal release and the structural features like flexibility that play a crucial role in efficient transfection. We have already developed a highly functionalized dPG-based polyamine (dPG-NH2 with 90% amine degree of functionalization (DF) and MW ~ 10 kDa) for siRNA transfection both in vitro and in vivo. However, the therapeutic window of this vector is too small that restricts its in vivo applications. Therefore, a major part of this Ph.D. thesis has focused on altering multiple structural features such as DF, the nature of the introduced amine groups, and dPG’s core size to acquire more efficient and safer siRNA delivery using dPG-NH2 analogues. First, in a structure-activity relationship study, we synthesized and evaluated dPG-NH2 analogues of various amine DFs (on dPG MW ~ 10 kDa) for siRNA complexation, cytotoxicity, and knockdown efficiency in vitro and in vivo. As a results, it was found that certain DF (i.e. 50% on a 10 kDa dPG) is necessary to achieve efficient siRNA transfection. This results was further confirmed by theoretical studies that predicted stronger interactions between dPG-NH2 analogues of 50% and higher DF with a 21-base pair DNA model. In the second part of this work, we functionalized dPG of high molecular weight (dPG Mn ~ 43 kDa) with amines of different DF to alter the ultimate safety profile of dPG- NH2 in vivo. The results of in vivo studies using dPG-NH2 50% (dPG Mn ~ 43 kDa) demonstrated much lower induced immune responses and higher luciferase knockdown efficiency compared to its analogues of lower molecular weight (dPG MW ~10 kDa). Therefore, an effective siRNA vector with optimal charge density was achieved which possess a high enough positive charge to promote cellular uptake and complex formation of siRNA at low N/P ratios but still has a low enough charge to avoid inducing immune responses. We further introduced arginine and histidine to the primary amines on the periphery of dPG (MW 10 kDa) to retain the effectiveness of siRNA transfection by dPG-NH2 while improving its cytotoxicity. As a results, an optimal siRNA vector with comparable transfection efficiency to Lipofectamine® and minimal cytotoxicity was obtained. Interestingly, introducing these amino acids improved both the in vitro transfection efficiency and cytotoxicity of dPG-NH2. Finally, bispecific antibodies (bsAbs) with dual specificity were recruited for delivery of dPG-based prodrug conjuagtes functionalized with a hapten called digoxigenin, into MCF-7 cells expressing LeY antigens. In this study, the targeted binding and internalization of dPG prodrug conjugates was demonstrated. However, no target specific toxicity was observed for digoxigenin functionalized dPG prodrug conjuagtes that might be attributed to the non-specific interaction and uptake of prodrug conjugates that strongly compete with active route of delivery. All the studies that have been presented in this work emphasize on a diligent and tailor-made design of dPG- based delivery systems according to their final application. Hence, certain amine DFs are necessary to obtain efficient siRNA transfection in vitro and in vivo. Furthermore, dPG-NH2 of higher molecular weight and lower DF compared to its analogue of lower molecular weight shows superior siRNA transfection and safer toxicity profile in vivo. Additionally, the nature of amine groups as siRNA complexing agents and the presence of groups that promote endosomal release properties are likely key elements for efficient and safe siRNA transfection. Last but not least, active targeting strategies like application of bsAbs can be adapted for tissue specific siRNA delivery.
