Themengebiet 1 Bedeutung neuartiger endothelial sezernierter vasoaktiver Mediatoren auf den Gefäßtonus Eine Fragestellung war es, neue vasoaktive Mediatoren aus dem Überstand von stimulierten HMEC zu isolieren. Durch eine Kombination aus chromatographischen, massenspektrometrischen und physiologischen Versuchen konnten zwei purinerge Mediatoren, Up4A und Ap4, isoliert werden, die eine potente vasoaktive Wirkung auf das renale Perfusionssystem ausüben. Up4A ist das erste gemischte Dinukleosidpolyphosphat, das sowohl P2X als auch P2Y Rezeptoren aktiviert. Am Modell der isoliert perfundierten Rattenniere zeigt Up4A eine Katecholaminen vergleichbare vasoaktive Wirkung. Durch die Aktivierung des P2X1,3 induziert Up4A einen potenten, aber selbstlimitierenden Anstieg des Perfusionsdrucks, der über die Desensitisierung des P2X1 zu erklären ist. Durch die Aktivierung des P2Y2 induziert Up4A einen geringeren, aber kontinuierlichen Perfusionsdruckanstieg. Durch den Einfluss von Up4A sind damit sowohl kurzfristige potente Änderungen der lokalen Flussverhältnisse als auch langanhaltende systemische Blutdruckmodifikation möglich. Die erhöhte Up4A Plasmakonzentration bei juvenilen Hypertonikern ist mit wichtigen klinischen Parametern, wie linksventrikuläre Wanddicke und IMT, assoziiert. Ap4 konnte zum ersten Mal aus humanen Zellen isoliert werden. Unter den purinergen Mediatoren ist Ap4 dasjenige mit der größten vasoaktiven Potenz im renalen Gefäßsystem, wobei eine hohe Affinität zum P2X1 besteht. Im Gegensatz zu ATP, das schnell durch endogene Endonukleasen abgebaut wird, zeigt Ap4 eine deutlich geringere Abbaurate. Damit scheint es sich um ein Mononukleotid zu handeln, das aufgrund seiner hohen vasoaktiven Potenz neben der parakrinen Sekretion auch im Rahmen einer endokrinen Sekretion eine Wirkung auf den systemischen Blutdruck ausübt. Neben der direkten vasoaktiven Wirkung über die Aktivierung von P2 Rezeptoren konnte gezeigt werden, dass purinerge Mediatoren die Vasoaktivität anderer bekannter Mediatoren, wie beispielsweise AngII, durch Aktivierung der RhoK potenzieren kann. Die Phosphorylierung der MLC in VSMC ist ein bedeutender Parameter für den vaskulären Gefäßtonus. Das Ausmaß dieser MLC Phosphorylierung ist stark abhängig von der Aktivität der Kalzium/Calmodulin abhängigen MLC Kinase und der Aktivität der MLC Phosphatase. Durch eine kalziumunabhängige Verminderung der Aktivität der MLC Phosphatase kann somit bei unveränderter intrazellulärer Kalziumkonzentration der Vasotonus steigen. Diese Verminderung wird durch RhoA induziert, das die RhoK stimuliert, die die MLC Phosphatase phosphoryliert und damit inhibiert. Dadurch wird eine gesteigerte Sensibilisierung der Zellen gegenüber der intrazellulären zytosolischen Kalziumkonzentration bewirkt. Gp5G aktiviert über die Stimulation des P2Y4 und/oder P2Y6 RhoA, so dass eine Sensibilisierung des renalen Perfusionssystems beispielsweise für die AngII induzierte Vasokonstriktion induziert wird. Nukleotide können somit zu einer Erniedrigung der EC50 von bekannten Vasokonstriktoren bei unveränderter Vmax über die Kalziumsensibilisierung beitragen. Themengebiet 2 Bedeutung von neuen endogenen Faktoren auf die Atherogenese In einer initialen Arbeit konnten erstmalig die Lysophospholipide S1P, SPC und LSF als die HDL assoziierten Moleküle identifiziert werden, die für direkte zellvermittelte Effekte von HDL verantwortlich sind, wie beispielsweise die S1P3 vermittelte eNOS Aktivierung über Stimulierung der PI3-K und Akt. In einer Folgearbeit zeigte der oral verfügbare Lysophospholipid basierten Immunmodulator FTY720 die gleichen Eigenschaften wie HDL und S1P. FTY720 aktiviert S1P1,3,4,5 Rezeptoren. Nach Aktivierung des S1P3 werden PI3-K und Akt stimuliert, was in einer eNOS Aktivierung resuliert. Somit stellt eine Lysophospholipid basierte Therapie einen interessanten neuen Ansatz auch außerhalb der Immunsuppression dar. Die ermittelten in vitro Erkenntnisse der möglichen antiatherosklerotischen Wirkung von FTY720 durch eNOS Stimulation konnten anschließend in einem Tiermodell der induzierbaren Atherosklerose, einer ApoE-/- Maus, in vivo reproduziert werden. Nach Fütterung der Tiere mit FTY720 konnte eine reduzierte Atherosklerosebildung beobachtet werden. In einer weiteren Arbeit konnte der Effekt auf die MCP1 Expression und Sekretion ebenfalls für HDL, S1P und SPC nachgewiesen werden. Die Thrombin induzierte MCP1 Expression und Sekretion aus VSMC wird durch HDL, S1P und SPC über die Stimulation des S1P3 inhibiert. In der Signaltransduktion wird die NADPH Oxidase und damit die ROS abhängige Stimulation der MCP1 Expression inhibiert. Erstmalig konnten somit die HDL assoziierten Lysophospholipide als funktionelle antiatherosklerotisch wirksame HDL Komponenten und der S1P3 als funktioneller HDL Rezeptor identifiziert werden. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass Up4A über die Aktivierung purinerger Rezeptoren, wie die des P2Y2, ein potenter Induktor des proatherogen wirkenden Zytokins MCP1 über die Aktivierung der NADPH Oxidase und Produktion von Sauerstoffradikalen ist. Somit beeinflusst Up4A über purinerge Rezeptoren neben dem Gefäßtonus auch über strukturelle Gefäßwandveränderungen die vaskuläre Regulation, was die Bedeutung des purinergen Systems unterstreicht.
Topic 1 The role of novel secreted endothelial vasoactive mediators on vascular tone One aim was to isolate new vasoactive mediators from the supernatant of stimulated HMECs. Using a combination of chromatographic, mass spectrometric and physiological experiments, two purinergic mediators, uridine-adenosine tetraphosphate (Up4A) and adenosine tetraphosphate (Ap4), could be isolated with potent vasoactive properties on renal vasculature. Up4A is the first mixed dinucleosidpolyphosphate activating both P2X and P2Y receptors. In the model of isolated perfused rat kidney, Up4A has vasoactive properties comparable with that of catecholamines. By activation of P2X1 and 3 receptors, Up4A induces a potent, but self-limiting increase of the perfusion pressure, which can be explained by desensitization of the P2X1 receptor. By activation of the P2Y2 receptor, Up4A induces a lower but continuous increase of the perfusion pressure. Due to the influence of Up4A, short and potent changes of the local blood flow as well as long-lasting systemic blood pressure modifications are therefore possible. The increased plasma concentration of Up4A in juvenile hypertensives is associated with important clinical parameters, such as left ventricular wall thickness and intima media thickness. Another mononucleosidpolyphosphate, Ap4, could be isolated for the first time from human cells. Among purinergic mediators, Ap4 is that with the highest vasoactive potency due to the highest affinity to the P2X1 receptor. In contrast to ATP, which is rapidly degraded by endogenous endonucleases, Ap4 shows a significantly lower rate of degradation. Therefore, Ap4 seems to be a mononucleosidpolyphosphate with potent paracrine as well as potent systemic vasoactive effects. The vasoactive potency of other mediators, like angiotensin II (AngII) can be enhanced by mononucleosidpolyphosphates like Gp5G via stimulation of Rho kinase (RhoK). The phosphorylation of myosine light chain (MLC) in vascular smooth muscle cells (VSMC) is an important parameter for the vascular tone. The extent of the MLC phosphorylation is dependent on the activity of the calcium/calmodulin dependent MLC kinase and MLC phosphatase. By inhibition of MLC phosphatase, which is calcium independent, the vasotonus could be altered in the presence of unchanged intracellular calcium concentration. This inhibition of MLC phosphatase is induced by RhoA, which stimulates RhoK leading to a phosphorylation and inhibition of MLC phosphatase. The effected cells show an increased sensitization to the intracellular cytosolic calcium concentration. In the renal vasculature, RhoA is activated by Gp5G via activation of P2Y4 and/or P2Y6 leading to a sensitization of this system to other vasoconstrictors, like AngII. Topic 2 The role of novel endogenous mediators on atherogenesis In an initial work, the lysophospholipids sphingosine-1-phosphate (S1P), sphingosylphosphorylcholin (SPC) and lysophosphatide (LSF) could be identified as the HDL associated molecules responsible for direct cell mediated HDL effects, like eNOS stimulation via S1P3 receptor and ongoing activation of PI3 kinase and Akt. In a subsequent work, the results could also be shown for the lysophospholipid based immunmodulator FTY720. FTY720 activates S1P1 and S1P3-5 receptors. Therefore, a lysophospholipid-based therapy could be an interesting approach for vascular treatment. The in vitro results could be validated in an animal model of inducible atherosclerosis, the ApoE knock-out mice. After feeding these mice with FTY720, the burden of atherosclerosis was significantly reduced in vivo. In a further study it could be shown that the MCP-1 expression and secretion from VSMCs after stimulation with thrombin was inhibited by HDL, S1P and SPC via stimulation of the S1P3 receptor and inhibition of the NADPH oxidase leading to a reduced ROS concentration. In summary, it could be shown for the first time that the HDL associated lysophospholipids are functional relevant components of HDL and that the S1P3 receptor is a functional HDL receptor. Moreover, it could be shown that purinergic agonists, like Up4A, are potent proatherogenic mediators. Up4A induce the MCP-1 expression and secretion via the P2Y2 receptor and activation of NAPDH oxidase and enhanced ROS production.
