Die Rolle von Stickstoffmonoxid in der frühen Phase der ischämischen Toleranz bei zerebraler Ischämie

Abstract

Der ischämische Schlaganfall gehört zu einer der schwerwiegendsten Erkrankungen mit hoher Mortalität und einer immensen sozioökonomischen Belastung. Trotz gewaltiger Anstrengungen in experimenteller und klinischer Forschung bleiben die therapeutischen Möglichkeiten dieses Krankheitsbildes limitiert. Im Gegensatz zu den verfügbaren Therapieoptionen wird die Anzahl der ischämischen Schlaganfälle in den nächsten Jahren aufgrund einer ständig älter werdenden Gesellschaft weiterhin ansteigen. Es ist daher unumgänglich, neue Therapiemöglichkeiten zu erforschen. Eine der Möglichkeiten liegt dabei in der endogenen Adaptation des Gehirns an schädigende Bedingungen. Diese gehirneigenen Schutzfunktionen werden auch als ischämische Präkonditionierung oder ischämische Toleranz (IT) bezeichnet und beschreiben ein Phänomen, in dem ein nicht schädigender Stimulus im Gehirn zu einem Zustand zeitweilig erhöhter Widerstandsfähigkeit gegen potentiell schädi-gende Ereignisse führt. IT entwickelt sich innerhalb von Minuten bis Stunden (frühe IT) oder innerhalb von Tagen (späte IT). Im Gegensatz zur späten IT ist das Wissen über die Eigenschaften und Mechanismen der frühen IT deutlich geringer. Das Ziel dieser Studie war es, die Methode der BCCAO (engl.: bilateral common ca-rotid artery occlusion) als präkonditionierenden Stimulus der frühen IT an einem 45 minütigen MCAO-Schadensmodell (engl.: middle cerebral artery occlusion) an C57Bl6 Mäusen zu etablieren und dabei das optimale Zeitfenster der frühen IT zu finden. Weitere Ziele waren die Testung der Unabhängigkeit der frühen IT von der de-novo Proteinsynthese sowie die Untersuchung von Stickstoffmonoxid (NO) innerhalb der frühen IT an eNOS (engl.: endothelial nitric oxide synthase) defizienten Mäusen sowie an Mäusen, welche mit einem Inhibitor der nNOS (engl.: neuronal nitric oxide synthase) behandelt wurden. Zur Überwachung des rCBF (engl.: regional cerebral blood flow) während BCCAO und MCAO nutzten wir in repräsentativen Gruppen die Laser-Doppler-Fluss Messung (LDF). Zweiundsiebzig Stunden nach MCAO entnahmen wir die Gehirne und verglichen durch Messungen an histologischen Schnitten die Infarktgrößen zwischen BCCAO präkonditionierten Tieren und nicht präkonditionierten Tieren. Um nachzuweisen, dass die Verwendung unseres BCCAO-Protokolls alleine zu keinem zerebralen Schaden auf zellulärer Ebene führt, nutzten wir die TUNEL Färbung (engl.: TdT-mediated dUTP nick end labeling), welche DNA-Schäden als Zeichen für Apoptose markiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass es sich bei der BCCAO um einen nicht schädi-genden ischämischen Stimulus handelt, der in der Lage ist, frühe IT zu induzieren, deren optimales Zeitfenster bei 30 Minuten nach BCCAO liegt. Darüberhinaus ist die von uns nachgewiesene frühe IT unabhängig von der de-novo Proteinsynthese. Die Mechanismen der frühen IT sind dabei abhängig von der eNOS und nNOS, da wir weder in eNOS Knock-out Tieren noch in mit nNOS- Inhibitor behandelten Tieren den Effekt der frühen IT nachweisen konnten.

Ischemic stroke is a disease with a high mortality and an enormous socio- economic burden. Despite experimental and clinical scientific efforts throughout recent decades, treatment options for acute ischemic stroke patients remain limited. In contrast to that, increase in the percentage of elderly people in developed countries will increase inci-dences and prevalences of patients with ischemic stroke in the next decades. Therefore, there is a pressing need for new treatment strategies in patients with ischemic stroke. One approach is to gain further understanding in mechanisms of endogenous adaptation of brain to cope with a damaging stimulus. This brain-derived neuroprotection is also known as ischemic preconditioning (PC) or ischemic tolerance (IT) and describes a phenomenon in which a non-damaging noxious stimulus applied to the brain induces a transient resistance against a subsequent damaging ischemic insult. IT occurs in two different time windows: early IT, which occurs within minutes to a few hours after PC and delayed IT, which needs hours or days to occur. So far, research on IT in brain has focused on delayed IT. Much less is known on the mechanisms of early IT. The objective of this study was to establish bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as an adequate PC stimulus to induce early IT to transient focal cerebral ischemia induced by 45 minutes middle cerebral artery occlu- sion (MCAO) in C57Bl6 mice. Furthermore, we looked for the optimal time window to induce early IT and investi-gated whether endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) derived nitric oxide play crucial roles in establishing this phenomenon using eNOS knock-out mice or a specific nNOS inhibitor. To demonstrate that preconditioning effect was due to early IT we tested also for independency of de-novo protein synthesis. During both surgical procedures (BCCAO and MCAO), monitoring of regional cerebral blood flow (rCBF) by laser Doppler flowmetry (LDF) was performed in a representative group of animals. Seventytwo hours after MCAO, we removed brains and compared infarct sizes between preconditioned and non- preconditioned animals. We used TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) staining to investigate non-damaging characteristics of our BCCAO preconditioning protocol. Our data indicated that our BCCAO-protocol is a non- damaging ischemic stimulus leading to early IT with the optimal time delay between BCCAO and MCAO of 30 min. Moreover, we could show that early IT is independent of protein de-novo synthesis and that eNOS and nNOS are necessary to induce this effect.