Klinische, biochemische und immunologische Aspekte des C-reaktiven Proteins des Hundes

Abstract

Das cCRP spielt als major Akute-Phase-Protein beim Hund eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Regulation von Entzündungsprozessen. Die Bildung und Freisetzung durch Hepatozyten aufgrund eines Interleukin-Stimulus folgt dem Entzündungsreiz innerhalb von 4 Stunden. Dieser schnelle Anstieg bei akuten Entzündungsreaktionen zeichnet CRP als nützlichen Biomarker für die Überwachung von Patienten und Therapieerfolgen aus – sowohl beim Hund wie auch beim Menschen. Ein Ziel der Arbeit war daher die Evaluierung verschiedener Schnelltestsysteme für die Messung des cCRP. Grundvoraussetzung, um gute diagnostische Testverfahren zu entwickeln, ist eine möglichst genaue Kenntnis über den zu untersuchenden Parameter. Daher war ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit, den aktuellen Kenntnisstand über die strukturellen Eigenschaften des cCRP-Proteins sowie seine diagnostischen Einsatzmöglichkeiten zu erweitern. Da es sich bei dem cCRP-Protein um einen so genannten „Real-time“-Biomarker handelt, ist die Messung besonders bei Patienten in akuten Notfallsituationen diagnostisch wertvoll. Um solch eine Diagnostik durchführen zu können, sind entsprechende Schnelltestgeräte notwendig, die für den klinischen Einsatz geprüft sind. Im ersten Teil der Arbeit wurden daher drei verschiedene quantitative Schnelltestgeräte (TECO ©dogCRP-quant, EUROLyser solo cCRP, LifeAssays® canine CRP) für die Messung der cCRP-Konzentration in Serumproben von caninen Patienten der Klinik und Poliklinik für kleine Haustiere der Freien Universität Berlin evaluiert. Die Geräte wurden hinsichtlich ihrer Genauigkeit durch statistische Auswertung mit der Referenzmethode (ELISA) verglichen und darüber hinaus die Praktikabilität im klinischen Alltag bewertet. Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede in Bezug auf die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse (TETECOmedical 69%, TEEUROLyser 28,2%, TELifeAssays 30,3%), jedoch ist die Verwendung aller drei Schnelltestgeräte im klinischen Alltag möglich. Auch die Anwendbarkeit für Verlaufskontrollen ist möglich, allerdings ist hier zu beachten, dass immer dasselbe Testsystem verwendet werden sollte, da sich alle Geräte bezüglich Abweichung der absoluten cCRP-Konzentrationswerte unterscheiden. Der in einem dieser Schnelltestgeräte (TECOmedical) eingesetzte, neu entwickelte anticCRP- Antikörper wurde in biochemischen Analysen hinsichtlich seiner Qualität untersucht und auch für die meisten immunologischen Nachweisverfahren in dieser Arbeit verwendet. Dabei zeigte sich zum einen seine speziesspezifische Detektion von CRP bei Hundeartigen und zum anderen eine unspezifische Bindung an ein bisher nicht näher charakterisiertes bakterielles Protein. Im zweiten Teil der Studie wurden weitere Details über die Struktur des cCRP-Proteins generiert. Die bisher bekannten Daten aus in silico Studien zur RNA- und Aminosäuresequenz konnten durch die durchgeführten biochemischen Analysen von gereinigtem, nativem Serum-cCRP größtenteils bestätigt und darüber hinaus neue Struktureigenschaften charakterisiert werden. Es wurde einerseits eine Verkürzung der primären Aminosäuresequenz von bisher angenommenen 223 auf 204 Aminosäuren im nativen cCRP festgestellt, was möglicherweise eine Bedeutung bei der Freisetzung des Proteins aus Hepatozyten spielt. Außerdem wurden die spezifischen Proteinmodifikationen bezüglich Glykosylierungen analysiert und eine Ähnlichkeit mit dem humanen CRPGlykosylierungsmuster festgestellt. In einem dritten Teilprojekt wurde aufgrund der immunologischen Ähnlichkeit des cCRPs die Verwandtschaft mit dem anderer Tierarten untersucht. Hier gelang der Nachweis von immunreaktivem Protein mittels des anti-cCRP-Antikörpers in Einzeltieren nur aus der Gruppe der Caniformia. Bei den übrigen untersuchten Tierarten der Unterfamilie der Eutheria war durch den Antikörper kein CRP detektierbar. Es wäre aufgrund immunologischer Gemeinsamkeiten denkbar, die diagnostischen Möglichkeiten der cCRP-Analyse der veterinärmedizinischen Praxis zukünftig auch auf Wildtiere aus der Gruppe der Caniformia auszuweiten.

Canine C-reactive protein is a major acute phase protein in dogs that plays an important role in initiation and regulation of inflammatory processes. It is produced in hepatocytes after interleukin stimulus and is released in the circulation where it can be detected in serum within 4 hours after initiation of the inflammatory process. Human medicine routinely uses CRP as a diagnostic measure and it has potential for the use in veterinary clinical practice as a biomarker for monitoring health status and response to therapy. Therefore, one objective of the study was to evaluate three different point-of-care (POC) systems for the measurement of cCRP. However, to establish its diagnostic possibilities, many details about the parameter cCRP still need to be elucidated. Another objective of this study was to increase knowledge about cCRP, with a focus on structural details and use within the clinical setting. Measuring of cCRP may be particularly useful for application in emergency medicine, as it can help determine if the underlying problem is caused by an inflammatory process. In addition, it may be used in conjunction with other diagnostic measures to help determine how severe the health condition is. Point-of-care testing devices can be used to provide rapid measurement of cCRP, however testing and evaluation of their performance is necessary due to the current lack of data regarding their applicability in veterinary clinical practice. For the first part of the study, three different quantitative POC (TECO©dogCRP-quant, EUROLyser solo cCRP, LifeAssays® canine CRP) systems for measuring the cCRPconcentration in serum samples of dogs presented to the Small Animal Clinic, Freie Universität Berlin were evaluated. All assays were tested for their clinical applicability and precision was compared to the gold standard (ELISA). Results revealed distinct variations in their accuracy as well as reproducibility of values (TETECOmedical 69%, TEEUROLyser 28,2%, TELifeAssays 30,3%). However, all POC systems provide potential for their clinical usage not only in one-point measuring but also to monitor patients. For disease-monitoring, it is important to measure all parameters with the same POC system, because the measured cCRP-concentration varies between the assays as well as between assay and reference method. The anti-cCRP-antibody used in the TECOmedical device was also used in the majority of immunological analyses performed, to examine its’ quality and specificity. It was found that CRP could be detected by the antibody in different species from the Caniformia family while it was not detected in unrelated species but also reacts with some bacterial proteins, which are not specified yet. In the second part of the study, further information about the cCRP was determined. Specifically, in silico data about mRNA and amino acid (aa) sequence of cCRP were confirmed by biochemical analysis and new structural properties were characterized. The primary amino acid sequence was found to be shorter in the serum cCRP (204 aa) than the mRNA codes for cCRP (223 aa). This might have an influence on cCRP release from hepatocytes as well as protein activation. Furthermore, the specific glycosylated protein modifications were analyzed and revealed similar structure to human CRP. The importance of and immunological similarity with CRP in other species was examined in the third part of the study. CRP-protein could be detected in serum samples of different Caniformia species by the anti-cCRP-antibody, but failed to be detected in several species of the Eutheria family. However, the detection of CRP in the serum of dog-related species might increase the diagnostic possibilities for wild animals from the Caniformia family.