Relative Quantifizierung von Proteinen mittels Reverse Phase Protein Microarrays

Abstract

Im Gegensatz zum Genom ist das Proteom hochvariabel. Es variiert nicht nur von Organismus zu Organismus, sondern auch zwischen verschiedenen Geweben und innerhalb eines Gewebes von Zelle zu Zelle. Grund hierfür sind unter anderem unterschiedliche Splicevarianten und posttranslationale Modifikationen (PTMs). Diese sind zeitlich begrenzt, sehr dynamisch und abhängig vom Zellzyklus oder externen Stimuli und beeinflussen die Proteinzusammensetzung einer Zelle. Nur ein Bruchteil dieser Modifikationen spielt bei regulatorischen Prozessen eine Rolle. Eine der wichtigsten PTMs ist die Phosphorylierung von Proteinen, denn diese spielt eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion und damit einhergehend, der Veränderung des Proteoms. Zum Verständnis von Signaltransduktionsevents gehört die Analyse der zeitlichen und räumlichen Dynamik von posttranslationalen Modifikationen. Deswegen ist es von besonderem Interesse diese Änderung der Verhältnisse möglichst genau zu untersuchen. Proteinbasierte Nachweismethoden, wie die Analyse mittels Reverse Phase Protein Microarrays, sind in der Lage Änderungen des Proteoms direkt nachweisen zu können. Ziel dieser Arbeit war die relative Quantifizierung von Proteinen mittels RPMAs anhand der Stimulierung des PKA Signaltransduktionsweges. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde der gesamte Vorgang vom Herstellen der Microarrays, über den Assay auf den Slides und der Auswertung bis zur Stimulierung der Zellen optimiert. In diesem Zusammenhang wurden verschiedene Zelllinien und Stimuli getestet und die Lysebedingungen an die Anforderungen des Piezo-Spotter angepasst. Bei der Herstellung der RPMAs wurde auf eine möglichst kurze Verweildauer der Lysate und eine schnelle, automatisierte Herstellungsprozedur geachtet. Um die zeitlich unterschiedlich stimulierten Lysate miteinander vergleichen zu können wurde eine Normalisierung gegen den Gesamtproteingehalt am Ende des Assays durchgeführt. Eine Änderung der Signalintensität ist somit auf die Stimulierung und nicht auf einen unterschiedlichen Proteingehalt nach dem Spotten auf den Arrays zurückzuführen. Die Aktivierung des PKA Signaltransduktionsweges konnte in relativen Verhältnissen dargestellt werden. Es konnte durch Stimulierung eine Aktivierung der PKA nach wenigen Minuten gemessen werden. Wie die Ergebnisse zeigen, sind Phosphorylierungen im Zelllysat nur über einen begrenzten Zeitraum stabil und die Analysedauer ab Probennahme sollte möglichst kurz gehalten werden. Dabei traten biologische Varianzen auf, welche nicht durch die Optimierung des Protokolls oder eine verbesserte Auswertung zu korrigieren waren. Faktoren wie der Grad der Konfluenz oder der Druck des Zellkulturmediums haben bereits im Vorfeld einen Einfluss auf die Signaltransduktion und konnten, auch durch ein vorangegangenes Aushungern der Zellen und eine optimierte Herstellung der RPMAs selbst, nicht minimiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Quantifizierung mittels Reverse Phase Protein Microarrays möglich, jedoch von vielen Faktoren abhängig ist. Um die Vergleichbarkeit der Versuche, auch zwischen verschiedenen Laboren, zu gewährleisten ist eine strikte Einhaltung einheitlicher Protokolle von der Stimulierung der Zellen über die Prozessierung und Lagerung der Lysate unabdingbar.

In contrast to the genome, the proteome is highly variable. It not only differs from organism to organism but also between different tissues. Even cells within one tissue type may have different protein content. Reasons for this diversity are various splice variants and post translational modifications. These PTMs are time limited, highly dynamic and depend on external stimuli or cell cycle. However, only a fraction is involved in regulatory processes like cell signaling, transcription and translation. One modification that plays a vital role in signal transduction and therefore also in gene regulation, is the phosphorylation of proteins. In order to understand signal transduction events the investigation of phosphorylation time frames upon stimulation is crucial. Protein based methods like Reverse Phase Protein Microarrays are able to track these changes on the level they occur – the proteomic level. Using the PKA signal transduction network as a model system, the aim of this study was the relative quantification of proteins using the RPMA technique. Goal of this thesis was the relative quantification of proteins using reverse phase protein microarrays. The PKA signal transduction pathway was chosen as a model system to optimize various steps along the way from cell culture over the actual production of the array to the final data acquisition and evaluation. Diverse stimuli and cell lines were tested and optimized for parameters like PKA activation, protein content and lysis conditions. To ensure automated high quality microarray production, fabrication times could be reduced to a minimum. On-array normalization was established to guarantee suitable estimation of all changes to the number of proteins immobilized on the array. The activation of the PKA signal transduction pathway could be monitored in relative amounts. Upon stimulation of the cells, PKA activity was measured after a couple of minutes and was depleted after 45 minutes. As the results show, phosphorylations are only stable for a limited amount of time. As a direct consequence the time between the stimulation experiment and the actual assay on the RPMA have to be kept as short as possible. Parameters like confluence of the cells or changes in pressure on top of the cells influence the phosphorylation pattern in signal transduction cascades before / during and after starvation and stimulation. Such parameters can neither be normalized by total protein staining nor be corrected by an improved fabrication protocol. Results showed that relative quantification of proteins using reverse phase protein microarray technology is possible. The outcome is greatly influenced by various factors along the production chain. Factors like sample processing and storage have a high impact on the stability and amount of PTMs measured. In order to be able to compare the results, not only from day to day, but also with different laboratories, the strict adherence to standard operation procedures is mandatory.