PIPKIgamma und AP-2 regulierte Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat-Synthese in der Clathrin-vermittelten Endozytose

Abstract

Das Phospholipid Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PI(4,5)P2) ist an der Plasmamembran konzentriert und essentiell für die Clathrin-vermittelte Endozytose. Zelluläres PI(4,5)P2 wird hauptsächlich durch Phosphatidylinositol-4-Phosphat-5-Kinasen Typ I (PIPKI) synthetisiert. Bisher konnten drei verschiedene Isoformen - alpha, beta und gamma - in Säugetieren identifiziert werden. Von allen Isoformen ist PIPKIgamma vorwiegend im Hirngewebe exprimiert und bekannt, eine kritische Rolle in dem Recycling synaptischer Vesikel einzunehmen. Allerdings ist der exakte Mechanismus, involviert in die räumliche und zeitliche Regulation der PI(4,5)P2-Synthese in Bereichen Clathrin-vermittelter Endozytose, noch immer nicht verstanden. Neueste Ergebnisse deuten an, dass PIPKIgamma-p90 und Komponenten der endozytotischen Maschinerie, insbesondere der AP-2-Adaptor-Komplex, involviert sind. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass PIPKIgamma-p90 über seine C-terminale Schwanzdomäne mit den beiden AP-2-Domänen, beta2-Ohr und C-µ2, interagiert. Da beide Interaktionen über ein Peptid vermittelt werden, das aus dem PIPKIgamma-p90-C-Terminus stammt, wurde es für Kristallisationsansätze mit beiden AP-2-Domänen eingesetzt. Dieser Ansatz zeigte, dass die Interaktion des PIPKIgamma-p90 abgeleiteten Peptids YFPTDERSVYSPLH mit der Sandwich-Subdomäne des AP-2-beta2-Ohrs durch hydrophobe und aromatische Reste vermittelt wird, während die Interaktion mit C-µ2 ein YxxF-Motiv involviert. Interessanterweise konnte nachgewiesen werden, dass die beiden Interaktionstellen innerhalb der PIPKIgamma-p90 C-terminalen Domäne überlappen. Allerdings bestätigten umfassende Mutationsanalysen eine Involvierung beider Interaktionsstellen in die Interaktion der PIPKIgamma-p90-Schwanzdomäne mit AP-2. In Unterstützung der strukturellen und biochemischen Daten konnte beobachtet werden, dass die aus dem PIPKIgamma-p90-C-Terminus abgeleiteten Peptide die AP-2/Clathrin- abhängige Aufnahme von Antikörper-markierten beta1-Integrin-Molekülen in nicht-neuronalen Zellen beeinträchtigen. Der beobachtete Effekt war von beiden AP-2-Bindungsstellen, AP-2µ und beta2-Ohr, abhängig. Eine Rolle von PIPKIgamma und AP-2 in beta1-Integrin-Endozytose konnte ferner durch siRNA-vermittelte knockdowns unterstützt werden. Die AP-2/Clathrin-vermittelte Endozytose des Reporterproteins SynaptopHluorin in primären Neuronen aus dem Hippocampus von Ratten wurde signifikant durch die Überexpression verschiedener dominant- negativ wirkender Mutanten der PIPKIgamma-p90 C-terminalen Domäne beeinträchtigt. Die Verminderung der Endozytose synaptischer Vesikel war abhängig von der Fähigkeit der C-terminalen PIPKIgamma-p90-Domäne mit dem AP-2-beta2-Ohr und mit C-µ2 zu assoziieren. Diese Ergebnisse bestätigten die strukturbiologischen sowie biochemischen Analysen und bestärken weiter eine wichtige physiologische Rolle für die Komplexbildung zwischen AP-2 und PIPKIgamma-p90 in der Endozytose synaptischer Vesikel. Darüber hinaus deuten die Daten an, dass die Interaktion der PIPKIgamma-p90-Schwanzdomäne mit dem AP-2-Komplex nicht nur in die Regulation der AP-2-PIPKIgamma-p90-Komplexbildung involviert ist, sondern zusätzlich die Enzymaktivität von PIPKIgamma-p90 beeinflusst. Es kann ein Modell postuliert werden, dem zufolge multiple Interaktionen zwischen PIPKIgamma-p90 und AP-2 eine räumlich-zeitlich kontrollierte PI(4,5)P2-Synthese in Bereichen Clathrin- vermittelter Endozytose zur Folge haben.

The phospholipid phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P2) is concentrated at the plasma membrane and essential for clathrin mediated endocytosis. The majority of cellular PI(4,5)P2 is synthesized by phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase type I (PIPKI). Three different isoforms - alpha, beta and gamma - have been identified in mammals so far. Of all isoforms, only PIPKIgamma is predominantly expressed in the brain and known to play a critical role in synaptic vesicle recycling. However, the exact mechanism involved in spatial and temporal regulation of PI(4,5)P2 synthesis at sites of clathrin mediated endocytosis still remains elusive. Recent findings indicate that PIPKIgamma-p90 and components of the endocytic machinery, in particular the AP-2 adaptor complex, are involved. This work shows that PIPKIgamma-p90 interacts via its C-terminal domain with two domains of AP-2, namely beta2-ear and C-µ2. Since both interactions are mediated by a peptide found in the PIPKIgamma-p90 C-terminus, it was crystallized in complex with the two AP-2 domains, respectively. This approach revealed that the interaction of the PIPKIgamma-p90 C-terminus derived peptide YFPTDERSVYSPLH with the sandwich subdomain of beta2-ear is mediated via hydrophobic and aromatic residues, whereas the interaction with C-µ2 involves a YxxF motif. Interestingly, the two interaction sites within the PIPKIgamma-p90 C-terminal domain have proven to be overlapping. Indeed, extensive mutational analysis has confirmed that both interaction sites are implicated in the PIPKIgamma-p90 tail interaction with AP-2. In support of the structurally and biochemically derived data, PIPKIgamma-p90 tail derived peptides have been observed to affect AP-2/Clathrin-dependent uptake of antibody labeled beta1-Integrin molecules in non-neuronal cells. The monitored effect was dependent on both AP-2 binding sites, AP-2µ und beta2-ear. A role of PIPKIgamma and AP-2 in beta1-Integrin endocytosis was further supported by siRNA mediated knockdowns. AP-2/Clathrin mediated endocytosis of the reporter protein SynaptopHluorin in primary rat hippocampal neurons was significantly impaired by the overexpression of different dominant negative effective PIPKIgamma-p90 C-terminal domain mutants. The decrease of synaptic vesicle endocytosis was dependent on the PIPKIgamma-p90 C-terminal domain ability to associate with AP-2 beta2-ear and C-µ2. These results confirmed the structural and biochemical analysis and further support an important physiological role for complex formation between AP-2 and PIPKIgamma-p90 in synaptic vesicle endocytosis. Furthermore the data suggest that the interaction of PIPKIgamma-p90 tail domain with the AP-2 complex may not only be involved in the regulation of AP-2-PIPKIgamma-p90 complex formation, but in addition, influences the enzyme activity of PIPKIgamma-p90. A model can be postulated according to which multiple interactions between PIPKIgamma-p90 and AP-2 lead to spatio-temporally controlled PI(4,5)P2 synthesis at sites of clathrin mediated endocytosis.