Schilddrüsenhormone (SH) sind wichtige Regulatoren endokriner Signalwege, die den Stoffwechsel, das Wachstum und die Differenzierung von Zellen kontrollieren. SH gelangen über spezifische Transmembran Transporter (TT) in die Zelle und binden an die im Zellkern vorliegenden SH-Rezeptoren, um die Aktivitätsmuster von spezifischen Genabschnitten zu ändern. Das klinische Bild von Patienten mit defekten TT zeigt eine individuell ausgeprägte psychomotorische Minderentwicklung und eine muskuläre Hypotonie (Allan- Herndon-Dudley Syndrom). Ferner ist es wichtig, Substanzen (endokrine Disruptoren) zu identifizieren, welche die Funktionalität der TT beeinflussen können. In dieser Hinsicht, könnten diese endokrinen Disruptoren den Regelkreis der Hypothalamus-Hypohysen-Schilddrüsen Achse stören, wie dies bei Krebspatienten unter der Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren (z.B. Dasatinib) zu beobachten war. Zurzeit werden zur Charakterisierung von TT Methoden mit radioaktiv markierten Substraten verwendet. Diese Assays setzen jedoch geschulte Experimentatoren und spezielle Laboreinrichtungen mit höheren Sicherheitsvorkehrungen voraus. Der damit verbundene, große organisatorische Aufwand und die strengen Entsorgungsrichtlinien beeinträchtigen nicht selten die experimentelle Planung und Ausführung. Diese Einschränkungen können mit der neuen nicht-radioaktiven Detektionsmethode, welche die chemische Reaktion nach Izaak Kolthoff und Ernest Sandell aus den 1930-ern implementiert, umgangen werden. Diese Reaktion beruht auf den katalytischen Effekt von freien Iodid-Molekülen. Folglich kann diese Methode die TT-vermittelte Aufnahme von beliebigen, iodid-haltigen Substraten direkt über eine Farbreaktion quantifizieren und benötigt somit keine speziellen Moleküle zur Detektion. Um die neuartige Methode zu validieren, untersuchten wir den vom Monocarboxylat Transporter 8 (MCT8)-vermittelten T3 Transport in einem physiologischen (primäre murine Astrozyten) und einem genetisch modifizierten Zellsystem (MCT8-überexprimierende MDCK-1 Zellen), und verglichen diese Ergebnisse mit den radiometrisch ermittelten Daten. Parallel dazu ermittelten wir in MCT8-überexprimierenden MDCK-1 Zellen die T3 Aufnahme in Anwesenheit des transporter-spezifischen Inhibitors Bromosulphthalein und charakterisierten das MCT8-spezifische Substratspektrum. Die nicht-radioaktive Methode lieferte stets konsistente und reproduzierbare Daten, welche mit den radiometrisch erhobenen Ergebnissen unmittelbar vergleichbar waren. Trotz der eingeschränkten Sensitivität des neuartigen Assays, ist die nicht-radioaktive Methode durchaus ausreichend für einleitende und schnelle, funktionelle Untersuchungen von TT. Die ermittelten Daten können anschließend mit orthogonalen Methoden, wie bspw. der LC-MS/MS verifiziert werden. Zusammenfassend ermöglicht die nicht-radioaktive Iodid-Detektionsmethode, essentielle Charakteristika von TT schnell und zuverlässig zu erfassen. Die vielen technischen Vorteile, wie die vereinfachte experimentelle Handhabung, verkürzte Arbeitszeit und verringerten Materialkosten ebnen den Weg, sowohl grundlegende als auch schwerpunktmäßige Untersuchungen von weiteren TT durchzuführen. Besonders ist dies für Arbeitsgruppen mit begrenzten Ressourcen attraktiv. Mit der erfolgreichen Miniaturisierung des Assay-Formats auf 96-well Mikrotiterplatten wird der nicht-radioaktive Assay in Hochdurchsatz- Screenings von Substanzbibliotheken eingesetzt werden, um potenzielle endokrine Disruptoren zu identifizieren.
Thyroid hormones (TH) are prime molecular switches of endocrine pathways regulating cell metabolism, proliferation and differentiation. After entering the cell through TH-specific trans-membrane transporters (THTT), THs bind to their respective nuclear TH-receptor to alter the gene-expression pattern accordingly. Structural and mechanistic disparities in THTTs impede essential endocrine mechanisms, e.g. patients with inherited dysfunctional THTTs suffer from differently pronounced psychomotor retardation and muscular hypotonia (Allan-Herndon-Dudley syndrome). Likewise, it is crucial to disclose substances with effects on the functionality of THTTs (i.e. endocrine disruptors). These endocrine disruptors might impair the complex Hypothalamus- Hypophysis-Thyroid Axis, as observed with cancer patients who were treated with tyrosine kinase inhibitors, e.g. Dasatinib. Currently, techniques used to study the functionality of THTTs employ radioactively labeled substrates that require special expertise and lab facilities with higher safety standards. Further, corresponding regulatory and disposal issues delay the experimental planning extensively. These drawbacks are not encountered with the newly introduced nonradioactive approach that implements the chemical reaction described by Izaak Kolthoff and Ernest Sandell in the 1930s. Precisely because iodides catalyze this reaction, the uptake of any iodine-containing THTT substrate can be quantified by a colorimetric read-out, thus facilitates label-independent iodine-detection. For the validation of the non-radiometric method, we monitored the Monocarboxylate Transporter 8 (MCT8)-mediated T3 uptake in a physiological (primary murine astrocytes) and genetically modified cell model (MCT8-(overexpressing) MDCK-1 cells), subsequently re-evaluating these setups with the radiometric method. In parallel, we elucidated the kinetics of the transporter-specific inhibitor Bromosulphthalein and confirmed the MCT8-specific substrate spectrum in MCT8-MDCK-1 cells. Successively, all experimental setups underlined that the new methodology holds a great capability to deliver consistent and reproducible data that additionally aligned to radiometric assay results. Despite we observed assay sensitivity being finite, it is yet sufficient for an initial and simple functional testing of THTTs. The initial data obtained can then be verified in follow-up experiments applying orthogonal methods, e.g. LC-MS/MS. In summary, this work introduces a label-independent non-radiometric methodology that assists in characterizing essential aspects of THTTs. The recyclable reaction educts and technical advantages of the assay improved experimental handling, and extensively reduced workload, laboratory and material costs. Hence, this methodology encourages fast, initial functional testing of further THTTs, particularly in laboratories with restricted finances, expertise and facilities. By having minimized the non-radioactive assay format onto 96-wells microtiter plates, the next goal is to explore its applicability in high- throughput screenings of compound libraries for THTT-specific endocrine disruptors.