dc.contributor.author
Jayarama Naidu, Roopa
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:42:15Z
dc.date.available
2017-02-24T12:31:09.619Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/1483
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5685
dc.description.abstract
Schilddrüsenhormone (SH) sind wichtige Regulatoren endokriner Signalwege, die
den Stoffwechsel, das Wachstum und die Differenzierung von Zellen
kontrollieren. SH gelangen über spezifische Transmembran Transporter (TT) in
die Zelle und binden an die im Zellkern vorliegenden SH-Rezeptoren, um die
Aktivitätsmuster von spezifischen Genabschnitten zu ändern. Das klinische Bild
von Patienten mit defekten TT zeigt eine individuell ausgeprägte
psychomotorische Minderentwicklung und eine muskuläre Hypotonie (Allan-
Herndon-Dudley Syndrom). Ferner ist es wichtig, Substanzen (endokrine
Disruptoren) zu identifizieren, welche die Funktionalität der TT beeinflussen
können. In dieser Hinsicht, könnten diese endokrinen Disruptoren den
Regelkreis der Hypothalamus-Hypohysen-Schilddrüsen Achse stören, wie dies bei
Krebspatienten unter der Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren (z.B.
Dasatinib) zu beobachten war. Zurzeit werden zur Charakterisierung von TT
Methoden mit radioaktiv markierten Substraten verwendet. Diese Assays setzen
jedoch geschulte Experimentatoren und spezielle Laboreinrichtungen mit höheren
Sicherheitsvorkehrungen voraus. Der damit verbundene, große organisatorische
Aufwand und die strengen Entsorgungsrichtlinien beeinträchtigen nicht selten
die experimentelle Planung und Ausführung. Diese Einschränkungen können mit
der neuen nicht-radioaktiven Detektionsmethode, welche die chemische Reaktion
nach Izaak Kolthoff und Ernest Sandell aus den 1930-ern implementiert,
umgangen werden. Diese Reaktion beruht auf den katalytischen Effekt von freien
Iodid-Molekülen. Folglich kann diese Methode die TT-vermittelte Aufnahme von
beliebigen, iodid-haltigen Substraten direkt über eine Farbreaktion
quantifizieren und benötigt somit keine speziellen Moleküle zur Detektion. Um
die neuartige Methode zu validieren, untersuchten wir den vom Monocarboxylat
Transporter 8 (MCT8)-vermittelten T3 Transport in einem physiologischen
(primäre murine Astrozyten) und einem genetisch modifizierten Zellsystem
(MCT8-überexprimierende MDCK-1 Zellen), und verglichen diese Ergebnisse mit
den radiometrisch ermittelten Daten. Parallel dazu ermittelten wir in
MCT8-überexprimierenden MDCK-1 Zellen die T3 Aufnahme in Anwesenheit des
transporter-spezifischen Inhibitors Bromosulphthalein und charakterisierten
das MCT8-spezifische Substratspektrum. Die nicht-radioaktive Methode lieferte
stets konsistente und reproduzierbare Daten, welche mit den radiometrisch
erhobenen Ergebnissen unmittelbar vergleichbar waren. Trotz der
eingeschränkten Sensitivität des neuartigen Assays, ist die nicht-radioaktive
Methode durchaus ausreichend für einleitende und schnelle, funktionelle
Untersuchungen von TT. Die ermittelten Daten können anschließend mit
orthogonalen Methoden, wie bspw. der LC-MS/MS verifiziert werden.
Zusammenfassend ermöglicht die nicht-radioaktive Iodid-Detektionsmethode,
essentielle Charakteristika von TT schnell und zuverlässig zu erfassen. Die
vielen technischen Vorteile, wie die vereinfachte experimentelle Handhabung,
verkürzte Arbeitszeit und verringerten Materialkosten ebnen den Weg, sowohl
grundlegende als auch schwerpunktmäßige Untersuchungen von weiteren TT
durchzuführen. Besonders ist dies für Arbeitsgruppen mit begrenzten Ressourcen
attraktiv. Mit der erfolgreichen Miniaturisierung des Assay-Formats auf
96-well Mikrotiterplatten wird der nicht-radioaktive Assay in Hochdurchsatz-
Screenings von Substanzbibliotheken eingesetzt werden, um potenzielle
endokrine Disruptoren zu identifizieren.
de
dc.description.abstract
Thyroid hormones (TH) are prime molecular switches of endocrine pathways
regulating cell metabolism, proliferation and differentiation. After entering
the cell through TH-specific trans-membrane transporters (THTT), THs bind to
their respective nuclear TH-receptor to alter the gene-expression pattern
accordingly. Structural and mechanistic disparities in THTTs impede essential
endocrine mechanisms, e.g. patients with inherited dysfunctional THTTs suffer
from differently pronounced psychomotor retardation and muscular hypotonia
(Allan-Herndon-Dudley syndrome). Likewise, it is crucial to disclose
substances with effects on the functionality of THTTs (i.e. endocrine
disruptors). These endocrine disruptors might impair the complex Hypothalamus-
Hypophysis-Thyroid Axis, as observed with cancer patients who were treated
with tyrosine kinase inhibitors, e.g. Dasatinib. Currently, techniques used to
study the functionality of THTTs employ radioactively labeled substrates that
require special expertise and lab facilities with higher safety standards.
Further, corresponding regulatory and disposal issues delay the experimental
planning extensively. These drawbacks are not encountered with the newly
introduced nonradioactive approach that implements the chemical reaction
described by Izaak Kolthoff and Ernest Sandell in the 1930s. Precisely because
iodides catalyze this reaction, the uptake of any iodine-containing THTT
substrate can be quantified by a colorimetric read-out, thus facilitates
label-independent iodine-detection. For the validation of the non-radiometric
method, we monitored the Monocarboxylate Transporter 8 (MCT8)-mediated T3
uptake in a physiological (primary murine astrocytes) and genetically modified
cell model (MCT8-(overexpressing) MDCK-1 cells), subsequently re-evaluating
these setups with the radiometric method. In parallel, we elucidated the
kinetics of the transporter-specific inhibitor Bromosulphthalein and confirmed
the MCT8-specific substrate spectrum in MCT8-MDCK-1 cells. Successively, all
experimental setups underlined that the new methodology holds a great
capability to deliver consistent and reproducible data that additionally
aligned to radiometric assay results. Despite we observed assay sensitivity
being finite, it is yet sufficient for an initial and simple functional
testing of THTTs. The initial data obtained can then be verified in follow-up
experiments applying orthogonal methods, e.g. LC-MS/MS. In summary, this work
introduces a label-independent non-radiometric methodology that assists in
characterizing essential aspects of THTTs. The recyclable reaction educts and
technical advantages of the assay improved experimental handling, and
extensively reduced workload, laboratory and material costs. Hence, this
methodology encourages fast, initial functional testing of further THTTs,
particularly in laboratories with restricted finances, expertise and
facilities. By having minimized the non-radioactive assay format onto 96-wells
microtiter plates, the next goal is to explore its applicability in high-
throughput screenings of compound libraries for THTT-specific endocrine
disruptors.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
non-radioactive
dc.subject
thyroid-hormone
dc.subject
hormone-transporter
dc.subject
sandell-kolthoff
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Etablierung und Validierung einer neuartigen nicht-radioaktiven Methode zur
Analyse der Funktionalität von spezifischen Schilddrüsenhormon-
Transportermolekülen
dc.contributor.contact
roopa.jayarama-naidu@charite.de
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2017-03-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000103979-2
dc.title.translated
A nonradioactive uptake assay for rapid analysis of thyroid hormone
transporter function
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000103979
refubium.note.author
Publikationspromotion
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000020834
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access