Die Arbeit hatte zum Ziel, den Embryonalen Stammzelltest (EST) durch die Etablierung von molekularen Endpunkten weiter zu entwickeln. In Vorversuchen wurden molekulare Endpunkte für die Erfassung der Herzmuskelzelldifferenzierung geprüft. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Etablierung eines Protokolls basierend auf einem neuen Endpunkt zur Erfassung von Substanzeffekten auf die neuronale Differenzierung sowie in der Charakterisierung der sich differenzierenden neuralen Zellen. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die Differenzierung zu Herzmuskelzellen anhand der Marker für die skelettalen Muskelzellproteine MHC (myosin heavy chain) und α-Actinin immunfluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen und im Durchflusszytometer quantitativ erfasst werden kann. Anhand einer Zeitanalyse über 20 Tage wurde festgestellt, dass der optimale Zeitpunkt für die Messung der beiden intrazellulären Proteinmarker der Tag 7 der Differenzierung ist. Die neuen molekularen Endpunkte wurden anhand von drei in der Validierungsstudie klassifizierten Substanzen 5-Fluorouracil, all-trans Retinsäure und Penicillin G mit dem validierten Endpunkt, der mikroskopischen Erfassung der Herzmuskelzell-kontraktionen, verglichen. Bei der Ermittlung der ID50-Werte für die 50%ige Hemmung der Differenzierung wurden gut übereinstimmende Ergebnisse erzielt. Für die Optimierung eines Protokolls zur neuralen Differenzierung wurden insbesondere die Einflussfaktoren Zellzahl, Mediumzusammensetzung und Beschichtungsform untersucht. Zunächst wurden die D3 Zellen auf Gelatine-beschichteten Zellkulturplatten differenziert, auf Basis dessen die meisten Substanztestungen durchgeführt wurden. Über die Zeit führten weitere Optimierungsschritte zu einem Protokoll, bei dem die Zellen auf Poly-L-Ornithin- (PLO)-beschichteten Platten unter Zugabe von Laminin differenziert wurden. Damit konnte nachweislich der Anteil an differenzierten Neuronen in der Kultur erhöht werden. Anhand beider Protokollvarianten wurde gezeigt, dass die mES Zellen während der voranschreitenden Differenzierung eine zeitlich gestaffelte Entwicklung durchlaufen, beginnend mit der Proliferation neuraler Vorläuferzellen bis hin zur Bildung reifer Neuronen und Gliazellen. Dies wurde anhand von zelltypischen Markern für Vorläuferzellen, Neuronen und Gliazellen immunfluoreszenz-mikroskopisch dokumentiert. Mit Hilfe von durchflusszytometrischen Analysen gelang es neuronale und gliale Proteine anhand der Marker Mikrotubulin-assoziiertes Protein 2 (MAP2), ß-Tubulin III, α-Internexin, saures gliale Faserprotein (GFAP) und 2',3'-zyklisches Nukleotid 3'-Phophodiesterase (CNPase) über die Zeit von 30 Tagen zu quantifizieren. Der Nachweis von synaptischen Vesikeln und Neurotransmittern lieferte zudem Hinweise auf die Entwicklung funktional ausgereifter Neuronen und Gliazellen. Des Weiteren reagierten die differenzierten Zellen auf die Stimulierung mit Neurotransmitter bzw. deren Agonisten spezifisch mit einem Anstieg an intrazellulärem Ca2+, was auf die Ausbildung von Glutamat- und Dopamin- spezifischen Rezeptoren schließen lässt. Die quantitativen Untersuchungen zeigten, dass die Neuronen anhand des Markers MAP2 am Tag 12 der Differenzierung standardisiert erfasst werden können. Anhand von Substanztests mit 5-Fluorouracil, Penicillin G, Lithiumchlorid, Valproinsäure und Methylazoxymethanolacetat wurde demonstriert, dass durch die Bestimmung dieses Endpunktes in den meisten Fällen reproduzierbare Konzentrations-Wirkungskurven erzeugt werden können. Im Vergleich zu den Daten, die bei der Erfassung der Zellviabilität im MTT-Test erhoben wurden, zeigte es sich, dass der ID50-Wert für die Differenzierung mit dem IC50-Wert, dem Wert für die 50%ige Hemmung der Viabilität der sich differenzierenden Zellen, in den meisten Fällen zusammenfällt. Bei Lithiumchlorid war aufgrund der abweichend niedrigeren ID50-Werte ein spezifischer Effekt auf die Differenzierung von MAP2-positiven Neuronen zu erkennen. Anhand der Untersuchung von Valproinsäure konnte zusätzlich gezeigt werden, dass sowohl bei der Differenzierung der Zellen nach dem Gelatine- als auch nach dem PLO-Protokoll, gleiche ID50- und IC50-Werte erzielt wurden.
The aim of this work was to improve the Embryonic Stem Cell Test (EST) further by establishing predictive molecular endpoints. Preliminary investigations were made to establish molecular markers in order to substitute the visual determination of the cardiac differentiation. The focus of this work was to develop a new molecular endpoint for measuring developmental neurotoxicity. For this purpose it was necessary to optimize a protocol for neural differentiation which is adequate for substance testing and also to characterize the differentiated neural cells. Applying immunofluorescence microscopy for qualitative and flow cytometry for quantitative analysis it has been shown that the skeletal proteins myosin heavy chain (MHC) and α-actinin are sensitive markers for the detection of myocardial differentiation. A 20 day quantitative analysis of the differentiation demonstrated, that both intracellular protein markers could be best monitored on day 7 of cultivation. With three substances previously tested in the EST validation study - 5-fluorouracil, all-trans retinoic and penicillin G - it was shown that comparable ID50 (concentration of half maximal inhibition of differentiation) values can be obtained using the molecular endpoints. In order to optimize a protocol for neural differentiation suitable for chemical testing, the main focus was determining the effect of the parameters cell count, medium composition and surface coating. First the cells were differentiated on gelatin-coated cell culture dishes, which most of the substance tests are based on. Further investigations led to the development of a poly-l-ornithin (PLO) based protocol supplemented with laminin, which enhanced the proportion of neurons in the differentiated culture. With both protocols it was shown, that the differentiation is a time-dependent, graduated developmental process which started with the proliferation of neural precursor cells and ended with the generation of mature neurons and glial cells. This was monitored, using immunofluorescence microscopy, by typical specific protein markers of precursor cells, neurons and glial cells. Using the markers microtubule- associated protein 2 (MAP2), ß-tubulin III, α-Internexin, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase), neurons and glial cells were also quantified by flow cytometry analysis until day 30 of differentiation. The presence of presynaptic vesicles and neurotransmitters indicated functional maturation of the differentiated cells. It was also shown, that the differentiated cells responded to different agonists of glutamate and dopamine receptors with temporary increases of intracellular Ca2+-levels. Quantitative investigations demonstrated that neurons were best detected with the protein marker MAP2 on day 12 of the differentiation. To evaluate the applicability of the endpoint, the substances 5-fluorouracil, penicillin G, lithium chloride, valproic acid and methylazoxymethanolacetate were examined applying flow cytometry analysis. Most of the tests showed reproducible concentration-response curves. When compared to the effect on cell viability recorded in the MTT-cytotoxicity assay it was shown, that the ID50 value for differentiation is mostly similar to the IC50 value for the half maximal inhibition of viability of all differentiating cells in culture. With lithium chloride, a specific effect was detected on the differentiating MAP2-positive neurons. Using valproic acid it was shown that both differentiation protocols (gelatin and PLO-protocol) generated identical ID50 and IC50 values.
