Die Rolle des Enhancer Zeste Homologs 2 im malignen Melanom

Abstract

EZH2 ist eine Histonmethyltransferase, die die Transkription reprimiert und an verschiedenen zellulären Prozessen wie der Stammzelldifferenzierung und frühen Embryonalentwicklung beteiligt ist. Weiterhin ist EZH2 in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert. Diese hohen Expressionslevel sind mit der Invasion und Metastasierung maligner Tumoren wie Brust- und Prostatakrebs assoziiert. Über die Expression und Rolle von EZH2 im malignen Melanom ist bisher wenig bekannt. Daher war es Ziel der vorliegenden Arbeit die EZH2-Expression in Melanomzelllinien im Vergleich zu Melanozyten sowie den Einfluß von EZH2 auf Proliferation und Migration zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Melanomzelllinien eine stärkere EZH2-Proteinexpression aufweisen als Melanozyten. Mittels immunfluoreszenz-mikroskopischer Untersuchungen wurde die zelluläre Lokalisation von EZH2 im Nukleus bestätigt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der siRNA vermittelte Knockdown von EZH2 mit einer verringerten Proliferation sowie migratorischen Aktivität assoziiert ist. Es wurde ein induzierbares Expressionssystem etabliert, mit dessen Hilfe die Expression des Fusionsproteins YFP-EZH2 in den Melanomzellen nach Doxyzyklinzugabe induziert werden konnte. Melanomzellen, die YFP-EZH2 überexprimieren, migrieren schneller als die entsprechenden Zellen mit endogener EZH2-Expression. Dagegen hat die YFP-EZH2-Überexpression keinen weiteren Einfluss auf die Proliferation der Melanomzellen. Durch Analyse von Transkriptomdaten wurden CDKN2B, TIMP3 und VASH1 als potentielle Zielgene von EZH2 identifiziert, deren mRNA-Expression invers mit der von EZH2 korrelieren. Nach Hemmung der EZH2-Expression wurde zudem bei CDKN2B, TIMP3 und VASH1 eine gesteigerte mRNA-Expression beobachtet. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass CDKN2B, TIMP3 und VASH1 unter der transkriptionellen Regulation von EZH2 stehen. Es liegt der Verdacht nahe, dass EZH2 die Karzinogenese durch epigenetische Repression dieser und anderer Zielgene vorantreibt. Prozesse wie die Proliferation, Metastasierung und Angiogenese könnten somit im malignen Melanom unter dem Einfluss der EZH2-Expression stehen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse bilden die Grundlage weiterer Analysen, um EZH2 als Onkogen im malignen Melanom zu bestätigen.

EZH2 is a histone methyltransferase that represses transcription and is involved in various cellular processes such as stem cell differentiation and early embryonic development. Furthermore, EZH2 is overexpressed in a variety of tumors. These high levels of expression are associated with the invasion and metastasis of malignant tumors such as breast and prostate cancer. However, the expression and role of EZH2 in malignant melanoma is poorly understood. The aim of the present work was to investigate the EZH2 expression level in melanoma cell lines compared to melanocytes as well as the influence of EZH2 on proliferation and migration. In the present work it was shown that melanoma cell lines express higher protein level of EZH2 compared to melanocytes. Using immunofluorescence microscopy analysis the cellular localization of EZH2 in the nucleus could be confirmed. Furthermore, it was shown that siRNA mediated knockdown of EZH2 is associated with decreased proliferation and migration. An inducible expression system has been established which induce the expression of the fusion protein YFP-EZH2 in melanoma cells after the addition of doxycyclin. Melanoma cells overexpressing YFP-EZH2 migrate faster than corresponding cells expressing endogenous EZH2. In contrast, the overexpression of YFP-EZH2 has no further influence on the proliferation of melanoma cells. By analyzing the transcriptome data CDKN2B, TIMP3 and VASH1 were identified as potential EZH2 target genes, whose mRNA expression correlates inversely to that of EZH2. The inhibition of EZH2 expression resulted in increased mRNA levels of CDKN2B, TIMP3 and VASH1. These results indicate that CDKN2B, TIMP3 and VASH1 are transcriptionally regulated by EZH2. It is hypothesized that EZH2 promotes carcinogenesis due to epigenetic repression of these and other target genes. Processes such as proliferation, metastasis and angiogenesis could be influenced by the EZH2 expression level in malignant melanoma. The results presented here form the basis of further research to confirm EZH2 as an oncogene in malignant melanoma.