Despite their central role in most regulatory processes and disease mechanisms, protein-protein interactions (PPIs) remain largely unconquered ground for drug discovery and chemical tool generation. In many cases, these interactions are mediated by protein interaction domains like Src homology 2 (SH2), Src homology 3 (SH3), WW, and postsynaptic density/Discs large/zona occludens-1 (PDZ). PDZ domains may be considered drugable because of a shallow ridge on their surface which is, however, not a proper cavity. They are hence good test cases for the development of PPI inhibitors. Prior to this study no small molecule reversible inhibitors for the PDZ domains were known. In this thesis we describe the discovery of competitive small molecule modulators for the AF6 PDZ domain. Also the 3D solution NMR structure of the AF6 PDZ domain and AF6 PDZ domain in complex with most active ligand is described. In our quest to find small molecule inhibitors for the PDZ domain, a small molecule library consisting of ~5000 compounds was screened against the AF6 PDZ domain. 2-thioxo-4-thazolidinone scaffold binding to the protein was identified and chosen for further optimization by simple chemical procedures. These modifications lead to the design of a compound with 100 µM binding affinity and a molecular weight of 291 Da. To understand the mode of binding of this compound to the AF6 PDZ domain and to guide further structure based ligand design 3D structure of the complex was determined by NMR spectroscopy. The 3D structure reveals a new hydrophobic subpocket formed through induced-fit binding of the small molecule ligand. This finding redefines the drugability of PDZ domains and discloses 5-aryl-2-thioxo-4-thiazolidinones and related frameworks as promising candidates for the development of potent and selective small-molecule modulators of individual domains from the large PDZ family.
PDZ-Domänen kommen im menschlichen Genom häufig vor und sind bie der Bildung komplexer Signaltransduktionsnetzwerke involviert. Es wird angemommen, dass PDZ-Domänen eine wichtige Rolle in Krankheitsprozessen spielen. Dies macht sie zu interessanten zielen für das Design von Protein-Protein- Interaktionsinhibitoren. Diese aus ~90 Aminosäureresten bestehenden Domänen erkennen meist die vier bis sieben C-terminalen Reste von Membranrezeptoren und Ionenkanälen. Aufgrund ihrer zwar flachen aber gut definierten flachen Bindungsfurche gelten sie als gute Ziel-Proteine für die Entwicklung von Protein-Protein-Interaktionsinhibitoren. Bis zu dieser Studie waren keine reversibel-bindenden kleinen Moleküle als Inhibtoren für PDZ-Domänen bekannt. Daher war das hauptsächliche Ziel dieser Studie das Auffinden neuer, nicht- kovalenter kompetitiver kleiner Inhibitormoleküle. Als Modellsystem wurde die AF6-PDZ-Domäne als Zielprotein für Ligandenscreens und Entwicklungszwecke eingesetzt. Das humane AF6-Protein (ALL-1 fusion partner on chromosome 6), auch als L-afadin bekannt, ist in zahlreichen Signaltransduktionswegen einschließlich dem Ras-Signaling involviert. Dieses Protein enthält zwei N-terminale Ras-Association-Domains , eine Fork-Head-Association-Domain (FHA), einen Class-V-Myosin-Homology-Repeat , der auch als Dilute-Domain bezeichnet, eine Klasse-II-PDZ-Domäne sowie eine prolinreiche Sequenz. Bei unserer Suche nach kleinen Inhibitormolekülen für die AF6-PDZ-Domäne, wurde eine Bibliothek von ~5000 kleinen Molekülen gescreent. Hierfür wurde NMR eingesetzt, 2D-1H-15N-HSQC-screening-Experimente mit 15N-markiertem Protein durchgeführt. Dabei 2-thioxo-4-thazolidinon als ein Substanzgerüst identifiziert, das an das Protein bindet. Dieses wurde für weitergehende Optimierung durch einfache chemische Verfahren ausgewählt. Systematische Modifizierung des Gerüstmoleküls führte zur Entwicklung von (2R, 5R)-2-sulfanyl-5-[4-(trifluoromethyl)benzyl]-1, 3-thiazol-4-on (7i), einer chiralen 291-Da-Verbindung mit einer Affinität von 100 µM für das racemische Gemisch. 15N-Filter-NMR Experimente zeigten, dass die Verbindung kompetitiv interagiert. Unter der Annahme, dass nur eines der Enantiomere bevorzugt bindet, kann die Affinität der Interaktion auf 50 µM geschätzt werden, was im Affinitätsbereich von natürlichen Peptidliganden liegt. Um die Interaktion zwischen der AF6-PDZ-Domäne und der Substanz 7i zu verstehen, und das künftige Struktur-basierte Liganden-Design zu erleichtern, wurden die Lösungs-NMR- Strukturen der PDZ-Domäne mit und ohne Ligand bestimmt. Die Strukturanalyse in Anwesenheit von 7i deutet auf die Bildung einer hydrophoben Subtasche in der Domäne hin, die in den veröffentlichten Strukturen von apo- und Peptid- gebundener PDZ-Domäne nicht vorhanden ist. Diese unerwartete bindungstasche, die durch Induced-Fit entsteht, definiert ein neues pharmakologisches Potential dieser Domäne und offenbart 5-aryl-2-thioxo-4-thiazolidinone und strukturell verwandte Verbindungen als vielversprechende Kandidaten für die Entwicklung von hochaffinen und spezifischen kleinen Modulator-Molekülen für einzelne Domänen der großen PDZ-Familie.
