This work presents results from FTIR measurements on photosystem II. In a previous project of our group, a custom made sample chamber was combined with a Vertex 70 spectrom- eter (Bruker, USA) to facilitate fully automated measurements (Süss 2011). In the current project, after several rectifications of the setup, time-resolved step-scan measurements of photosystem II in H2O and D2O have been completed successfully. Rapid-scan measurements showed that the sample fully retains its activity through three to four days of measurements. The influence of ammonium on photosystem II FTIR (rapid- scan) difference spectra was reported for the first time for all S-state transitions. Different methods to eliminate a signal in the microsecond to millisecond domain caused by heating of the sample upon the application of an actinic laser flash were introduced and discussed. Finally, the time-resolved step-scan H2O and D2O datasets were carefully analyzed and discussed. The miss factor of the rapid-scan and step-scan measurements was as low as 9%. In this work seven electron and proton removal steps of the S-state cycle have been identified using decay associated spectra obtained from different fitting approaches. Their time constants and kinetic isotope effects have been obtained. For the first time, the oxygen evolution spectrum in the S3 → S0 transition has been obtained: the vibrational modes which are involved in the oxygen evolution step can be identified unambiguously. Conclusions about the FTIR signature of YZ in intact photosystem II have been reported. The expected kinetic behaviour can be observed in certain protein backbone modes. The time- resolved step-scan and rapid-scan measurements show excellent agreement re- garding the comparably slow acceptor side processes. The decay-associated spectrum of a very fast phase (τ ≈ 20 μs) surprisingly shows agree- ment with P680 and ChlZ spectra. Two pairs of symmetric and asymmetric carboxylate modes match very well regarding the evolution in time in each S-state transition. These features are remarkably influenced by ammonia treatment and indicate substrate water movement during the catalytic cycle. It has been an important goal to assign individual amino acid residues around the OEC to specific vibrational modes, for example through the use of site-directed mutagenesis. Once more modes can be assigned to specific amino acid residues, the reported datasets can be revistited to obtain valuable information about the evolution in time of these modes.
Diese Arbeit präsentiert zeitaufgelöste FTIR-Spektren des Photosystem II. In einem vo- rausgegangenem Projekt wurde ein kommerzielles Spektrometer (Vertex 70, Bruker, USA) durch einen vollautomatisierten Probenwechsler ergänzt (Süss 2011). In diesem Projekt wurden nach kritischen Modifizierungen des Aufbaus erfolgreich zeitaufgelöste step-scan Messungen des PSII in H2O und D2O durchgeführt. In dieser Arbeit belegen rapid-scan Messungen, dass das Protein selbst während drei- bis viertägigen Messungen seine Aktivität behält. Der Einfluss von Ammonium auf PSII FTIR Differenzspektren wurde zum ersten Mal für sämtliche S-Zustandsübergänge präsentiert. Verschiedene Methoden zur Kompensierung eines wärmeinduzierten Signals im Mikrose- kunden- bis Millisekunden-Zeitbereich wurden vorgestellt und diskutiert. Schließlich wur- den die zeitaufgelösten step-scan Messungen in H2O und D2O ausführlich analysiert und diskutiert. Der Missfaktor der Messungen betrug nur 9%. Sieben Elektronen- und Protonenabstraktionsschritte des S-Zustandszyklus können mit Hilfe von Zerfallsspektren, die auf unterschiedliche Weise berechnet wurden, in den step- scan Daten identifiziert werden. Die Zeitkonstanten und der kinetische Isotopeneffekt dieser Schritte wurden berechnet. Zum ersten Mal wurde das Sauerstoffentwicklungsspek- trum im S3 → S0-Übergang präsentiert. Dadurch können nun eindeutige diejenigen Vibrationsmoden identifiziert werden, die in diesem Übergang modifiziert werden. Diese Arbeit geht auch auf die Signale von YZ -moden in intaktem PSII ein: das erwartete dynamische Verhalten kann in Proteinstruktursignalen beobachtet werden. Das mit einer sehr schnellen Phase (τ ≈ 20 μs) assoziierte Spektrum zeigt überraschen- derweise Übereinstimmungen mit P680 und ChlZ -Spektren. Zwei Paare von symmetrischen und asymmetrischen Carboxylatmoden spiegeln sehr gut ihr Verhalten im Zeitbereich während der S-Zustandsübergänge. Diese Moden werden auch durch Ammonium modifiziert und zeigen die Änderungen im Wasserstoffbrücken- bindungsnetzwerk rund um den OEC während des katalytischen Zyklusses. Ein wichtiges Ziel der derzeitigen PSII-Forschung ist es, spezifische FTIR-Signale spezifis- chen Amminosäureresten zuzuordnen, beispielsweise durch Punktmutationen. Die gewon- nenen Datensätze werden auch in Zukunft weitere wichtige Informationen liefern können, sobald diese Zuordnungen getroffen werden können.